dna实验设计方案-玉米基因组dna的提取与转基因成分分析.doc

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《生化实验技术》实验设计方案
实验项目：玉米基因组DNA的提取与转基因成分分析
专业：生物工程 班级：101 日期：11月5日
实验目的：
1、掌握提取植物组织基因组DNA的基本方法。
2、掌握二苯***法和紫外分光光度法测定DNA含量的原理和方法。
3、学会转基因植物转基因成分的分析
4、学****DNA的水平式琼脂糖凝胶电泳并学会操作。
5、掌握高速冷冻离心机、微量移液枪、水平电泳仪等仪器设备的使用。
实验原理：
核酸是生物有机物体重的重要组成成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起。核酸分为DNA和RNA两大类，前者主要存在于细胞核内，后者主要存在于细胞质及核仁里。
在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。苯酚可使蛋白质变性，蛋白质溶于酚相，DNA则溶于上层水相。将***仿与苯酚混合使用，可减少酚相中因水的存在而造成DNA的少量溶解。95%乙醇可使核酸从水相中沉淀出来，用70%的乙醇洗涤可以除一些盐分，经Rnase降解RNA，可得较纯的DNA。
DNA含量与纯度测定，目前常用紫外吸收法，利用核酸在260nm有吸收峰，根据公式[DNA(μg/mL)=A260*50*稀释倍数]可计算出核酸DNA的浓度。由于蛋白质在280nm有吸收峰，可根据比值判断DNA纯度：A260／A280＜，表明蛋白质含量偏高；＜A260／A280＜，表明样品较纯；A260／A280＞，表明RNA或DNA碎片较多。
二苯***法定量测定DNA的原理为：在强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，产生嘌呤碱基、脱氧核糖与嘧啶核苷酸。其中，2’-脱氧核糖在酸性环境中成为w-羟基-r-***基戊醛，此物与二苯***反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。DNA在40-400ug范围内光吸收值与DNA含量成正比。
在转基因技术中，外源基因导入到植物体中时，通常使用花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子启动下游编码基因的转录。在染色体中，一个转录单位由启动子序列，编码序列和终止序列组成，常用终止序列是胭脂碱合酶（NOS）的编码序列的终止序列。这部分序列相对于被
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导入植物而言，属于外来基因序列，所以非转基因植株不含该段核苷酸序列。针对CaMV35S启动子或NOS终止子序列进行分析，即可定性分析植株体是否为转基因品种。电泳（electrophoresis）是荷电溶质或粒子在电场作用下发生定向泳动的现象。核酸的分离和鉴定通常采用琼脂糖凝胶电泳。
不同大小、不同形状和不同构象的DNA 分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶（EB）染色，在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。
实验仪器：
离心机、冰箱、恒温水浴箱、紫外分光光度计、水平电泳槽、电泳仪电源、凝胶成像系统、量筒、移液管、烧杯、玻璃棒、试管、离心管、容量瓶等
四、材料与试剂（请写明具体配制方法及使用的量）：
1、材料：玉米片
2、试剂：
（一）基因组DNA的提取和纯化
（可选），1500单位/mg-3000单位/mg蛋白质
***甲烷（CHCl3）
%乙醇（C2H5OH）
***四乙酸二钠盐 Na2EDTA（C10H14N2O8Na2）
（C19H42BrN）
%盐酸（HCl）
（CH3CHOHCH3）
（可选），冷冻状态下约50单位/mg
（可选），不含DNA酶，冷冻状态下约50单位/mg
10.***化钠（NaCl）
（NaOH）
（C4H11NO3）
（可选）淀粉酶10mg/ML，不要灭菌。-20摄氏度保存，避免反复冻融
-1提取缓冲液（）
，***化钠，，，-40，用适量水溶解后，调节PH，定容至200ml，高压灭菌。临用前按使用量加入巯基乙醇，使其终浓度为2%。
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-2提取缓冲液（）
，***化钠，，，用适量水溶解后，调节PH，定容至200ml，高压灭菌。
（）
，***化钠，用适量水溶解后，调节PH，定容至200ml，高压灭菌。
17.***化钠溶液（NaCl），1