dna实验设计方案玉米基因组dna的提取与转基因成分分析.doc

《生化实验技术》实验设计方案实验项目:玉米基因组DNA的提取与转基因成分分析专业:生物工程班级:101日期:11月5日实验目的:1、掌握提取植物组织基因组DNA的基本方法。2、掌握二苯***法和紫外分光光度法测定DNA含量的原理和方法。3、学会转基因植物转基因成分的分析4、学****DNA的水平式琼脂糖凝胶电泳并学会操作。5、掌握高速冷冻离心机、微量移液枪、水平电泳仪等仪器设备的使用。实验原理:核酸是生物有机物体重的重要组成成分,在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起。核酸分为DNA和RNA两大类,前者主要存在于细胞核内,后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时,通过研磨破坏细胞壁和细胞膜,使核蛋白被释放出来。苯酚可使蛋白质变性,蛋白质溶于酚相,DNA则溶于上层水相。将***仿与苯酚混合使用,可减少酚相中因水的存在而造成DNA的少量溶解。95%乙醇可使核酸从水相中沉淀出来,用70%的乙醇洗涤可以除一些盐分,经Rnase降解RNA,可得较纯的DNA。DNA含量与纯度测定,目前常用紫外吸收法,利用核酸在260nm有吸收峰,根据公式[DNA(μg/mL)=A260*50*稀释倍数]可计算出核酸DNA的浓度。由于蛋白质在280nm有吸收峰,可根据比值判断DNA纯度:A260/A280<,表明蛋白质含量偏高;<A260/A280<,表明样品较纯;A260/A280>,表明RNA或DNA碎片较多。二苯***法定量测定DNA的原理为:在强酸、加热条件下,可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂,产生嘌呤碱基、脱氧核糖与嘧啶核苷酸。其中,2’-脱氧核糖在酸性环境中成为w-羟基-r-***基戊醛,此物与二苯***反应生成蓝色化合物,在595nm处有最大吸收。DNA在40-400ug范围内光吸收值与DNA含量成正比。在转基因技术中,外源基因导入到植物体中时,通常使用花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子启动下游编码基因的转录。在染色体中,一个转录单位由启动子序列,编码序列和终止序列组成,常用终止序列是胭脂碱合酶(NOS)的编码序列的终止序列。这部分序列相对于被导入植物而言,属于外来基因序列,所以非转基因植株不含该段核苷酸序列。针对CaMV35S启动子或NOS终止子序列进行分析,即可定性分析植株体是否为转基因品种。电泳(electrophoresis)是荷电溶质或粒子在电场作用下发生定向泳动的现象。核酸的分离和鉴定通常采用琼脂糖凝胶电泳。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下(如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等),有不同的迁移率,所以可通过电泳使其分离。琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶(EB)染色,在254nm波长紫外光照射下,呈现橙黄色的荧光。实验仪器:离心机、冰箱、恒温水浴箱、紫外分光光度计、水平电泳槽、电泳仪电源、凝胶成像系统、量筒、移液管、烧杯、玻璃棒、试管、离心管、容量瓶等四、材料与试剂(请写明具体配制方法及使用的量):1、材料:玉米片2、试剂:(一)(可选),1500单位/mg-3000单位/***甲烷(CHCl3)%乙醇(C2H5OH)***四乙酸二钠盐Na2EDTA(C10H14N2O8Na2)(C19H42BrN)%盐酸(HCl)(CH