2021年dna实验设计方案玉米基因组dna的提取与转基因成分分析.doc

《生化试验技术》试验设计方案
试验项目：玉米基因组DNA提取和转基因成份分析
专业：生物工程 班级：101 日期：11月5日
试验目标：
1、掌握提取植物组织基因组DNA基础方法。
2、掌握二苯***法和紫外分光光度法测定DNA含量原理和方法。
3、学会转基因植物转基因成份分析
4、学****DNA水平式琼脂糖凝胶电泳并学会操作。
5、掌握高速冷冻离心机、微量移液枪、水平电泳仪等仪器设备使用。
试验原理：
核酸是生物有机物体重关键组成成份，在生物体中核酸常和蛋白质结合在一起。核酸分为DNA和RNA两大类，前者关键存在于细胞核内，后者关键存在于细胞质及核仁里。
在制备核酸时，经过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。苯酚可使蛋白质变性，蛋白质溶于酚相，DNA则溶于上层水相。将***仿和苯酚混合使用，可降低酚相中因水存在而造成DNA少许溶解。95%乙醇可使核酸从水相中沉淀出来，用70%乙醇洗涤能够除部分盐分，经Rnase降解RNA，可得较纯DNA。
DNA含量和纯度测定，现在常见紫外吸收法，利用核酸在260nm有吸收峰，依据公式[DNA(μg/mL)=A260*50*稀释倍数]可计算出核酸DNA浓度。因为蛋白质在280nm有吸收峰，可依据比值判定DNA纯度：A260／A280＜，表明蛋白质含量偏高；
＜A260／A280＜，表明样品较纯；A260／A280＞，表明RNA或DNA碎片较多。
二苯***法定量测定DNA原理为：在强酸、加热条件下，能够使DNA中嘌呤碱基和脱氧核糖间糖苷键断裂，产生嘌呤碱基、脱氧核糖和嘧啶核苷酸。其中，2’-脱氧核糖在酸性环境中成为w-羟基-r-***基戊醛，此物和二苯***反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。DNA在40-400ug范围内光吸收值和DNA含量成正比。
在转基因技术中，外源基因导入到植物体中时，通常使用花椰菜花叶病毒CaMV35S开启子开启下游编码基因转录。在染色体中，一个转录单位由开启子序列，编码序列和终止序列组成，常见终止序列是胭脂碱合酶（NOS）编码序列终止序列。这部分序列相对于被导入植物而言，属于外来基因序列，所以非转基因植株不含该段核苷酸序列。针对CaMV35S开启子或NOS终止子序列进行分析，即可定性分析植株体是否为转基因品种。电泳（electrophoresis）是荷电溶质或粒子在电场作用下发生定向泳动现象。核酸分离和判定通常采取琼脂糖凝胶电泳。
不一样大小、不一样形状和不一样构象DNA 分子在相同电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不一样迁移率，所以可经过电泳使其分离。琼脂糖凝胶电泳分离后DNA可用溴化乙啶（EB）染色，在254nm波长紫外光照射下，展现橙黄色荧光。
试验仪器：
离心机、冰箱、恒温水浴箱、紫外分光光度计、水平电泳槽、电泳仪电源、凝胶成像系统、量筒、移液管、烧杯、玻璃棒、试管、离心管、容量瓶等
四、材料和试剂（请写明具体配制方法及使用量）：
1、材料：玉米片
2、试剂：
（一）基因组DNA提取和纯化
（可选），1500单位/mg-3000单位/mg蛋白质
***甲烷（CHCl3）
%乙醇（C2H5OH）
***四乙酸二钠盐 Na2EDTA（C10H14N2O8Na2）
（C19H42BrN）
%盐酸（HCl）
（CH3CHOHCH3）
（可选），冷冻状态下约50单位/mg
（可选），不含DNA酶，冷冻状态下约50单位/mg
10.***化钠（NaCl）
（NaOH）
（C4H11NO3）
（可选）淀粉酶10mg/ML，不要灭菌。-20摄氏度保留，避免反复冻融
-1提取缓冲液（）
，***化钠，，，-40，用适量水溶解后，调整PH，定容至200ml，高压灭菌。临用前按使用量加入巯基乙醇，使其终浓度为2%。
-2提取缓冲液（）
，***化钠，，，用适量水溶解后，调整PH，定容至200ml，高压灭菌。
（）
，***化钠，用适量水溶解后，调整PH，定容至200ml，高压灭菌。
17.***化钠溶液（NaCl），
%乙醇（C2H5OH）
（可选）蛋白酶K约20mg/m