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如何根据要求自己设计PCR引物1PCR引物设计课堂笔记○PCR这个名词大家都不陌生,但实际操作时我们常说的引物设计到底是怎么回事呢?今天我就来给大家用实例演示一下哈。首先,我们要知道引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计是PCR的关键,附上PCR的基本流程图: ○引物设计的原则::一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不能大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,即Taq酶的最适温度。:引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。:引物的Tm值一般控制在55-60度,尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度。退火温度=4×(G+C)+2×(A+T)-(5~8)+C含量:有效引物中(G+C)的比例为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。′端:引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰;引物3’端的碱基一般不用A,因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高;引物间3’端的互补、′端:引物的5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、***、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。下面以实例操作演示一下加酶切位点时如何自己设计引物:2用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1○简单点说,就是现在我们要把Plasmid2中GFP基因片段添加到Plasmid1中的NR1基因片段上,但是Plasmid2中GFP基因片段本身并没有BamHⅠ这个酶切位点,也就说我们要在引物设计中人为地把BamHⅠ这个酶切位点的序列添加给GFP基因片段,这样PCR后得到的GFP基因片段就可以通过BamHⅠ这个酶切位点进入到Plasmid1中,然后绿色荧光蛋白(GFP)就可以来标记蛋白NR1,达到我们之后实验中来观察蛋白NR1的目的,示意图见下。○已知NR1的编码序列(~4000bp) ○红色为信号肽,蓝色为BamHI酶切位点,下划线标出BamHI酶切位点的阅读框○此次引物设计的要求:PCR扩增GFP;GFP两边添加BamHI酶切位点;保证NR1的阅读框不改变。○第一步:扩增GFP基本序列○当终止密码子TAA位于整个阅读框的中间位置时,我们需要把其去掉,否则就不能表达全长融合蛋白了。○第二步:添加酶切位点,BamHI的识别位点()○引物1与引物2是反向互补的噢~○第三步:保护阅读框(很重要)○注意:紫色标注的就是一个阅读框,为了保证整个阅读框的完整性,此时我们发现引物1…?ATGGTG…后少了一个碱基,因此我们需要在引物1…?ATGGTG…问号处添加1个碱基g(补上的碱基可以任意选,但是尽量补成编码中性氨基酸的密码子),与此同时需要在引物2…??CTTGTACAG…问号处需添加2个碱基gg(要求同上)。若我们在引物1中已经补上2个碱基的话,那么在引物2中就只需补上1个碱基就好了。简单的记,就是引物1,2中补上的碱基数前后相加为3(即一个密码子的数量),这样就不会影响到后面阅读框的改变。○第四步:添加保护