如何设计PCR扩增引物.doc

1. 找出这种细胞物种的 PTN 全长核苷酸序列 2. 采用 primer premier 软件设计引物设计应注意如下要点: ? 1. 引物的长度一般为 15-30 bp ,常用的是 18-27 bp ,但不应大于 38 ,因为过长会导致其延伸温度大于 74 ℃,不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应[2] 。? 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高, 尤其是 3’端相似性较高的序列, 否则容易导致错配。引物 3’端出现 3 个以上的连续碱基,如 GGG C , 也会使错误引发机率增加[2] 。? 3. 引物 3’端的末位碱基对 Taq 酶的 DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率, 末位碱基为 A 的错配效率明显高于其他 3 个碱基, 因此应当避免在引物的 3’端使用碱基 A[3][4] 。另外, 引物二聚体或发夹结构也可能导致 PCR 反应失败。 5’端序列对 PCR 影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物[2] 。? 4. 引物序列的 GC 含量一般为 40-60% , 过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能相差太大[2][5] 。? 5. 引物所对应模板位置序列的 Tm 值在 72℃左右可使复性条件最佳。 Tm 值的计算有多种方法,如按公式 Tm = 4(G+C) + 2(A+T) ,在 Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) [6][7] 。? 值是指 DNA 双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用 3’端ΔG 值较低( 绝对值不超过 9 ),而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。引物的 3’端的ΔG 值过高, 容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应[6] 。? 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高( 超过 ) 易导致产生引物二聚体带, 并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行[8] 。? 8. 对引物的修饰一般是在 5’端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入 PCR 产物的载体的相应序列而确定。如果文献上的这个基因跟你是同一物种来源的话是可以运用别人的引物看看他的引物是基因组的还是 cDNA 的。 cDNA 的可以直接用。基因组的就再看看了好的引物对实验进程不会延缓我觉得在涉及引物只要遵循以下的原则,一般是没什么问题! 我是从来不借助什么专业软件来设计,按照自己的需要选取就是了,一般 20bp ,不浪费! 到目前还没有失败过! 引物设计和选择目的 DNA 序列区域时可遵循下列原则: (1) 引物长度约为 16-30bp , 太短会降低退火温度影响引物与模板配对, 从而使非特异性增高。太长则比较浪费, 且难以合成。(2) 引物中 G+C 含量通常为 40%-60%, 可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm=4(G+C)+2(A+T). (3) 四种碱基应随机分布,在 3' 端不存在连续 3个G或 C, 因这样易导致错误引发。(4) 引物 3' 端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。(5) 在引物内, 尤其在 3' 端应不存在二级结构。(6) 两引物之间尤其在 3' 端不能互补,