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荧光定量PCR引物设计要求
荧光定量PCR引物的具体设计要求:
。最好位于编码区5’端的300-400bp区域内,可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。
2. 产物不能形成二级结构()。
-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。
+C含量在40%~60%之间,45-55%最佳。
,尽量均匀。
。
。
′端可以修饰。
′端不可修饰,而且要避开AT,GC rich的区域,避开T/C,A/G连续结构(2-3个)。
10. 引物3′端要避开密码子的第3位。
‘端大于3’端,且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。
可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。
-150bp最好,最长是300bp.
,最好跨外显子接头区。
%或者有8个互补碱基同源。
。假基因就是无功能的DNA序列,与需要扩增的目的片段长度相似。
-62度之间。
有专门针对荧光的。
ATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG
5' GAGC 3'
5' AG 3'
ATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG
5' GAGC 3'
5' CAACAGTCTTTTGAGTGGCAG 3'
5' GAGC 3'
5' TCAAC 3'
5' GAGC 3'
5' 3'
5' 3'
5' AAAC 3'
TKGAPDH内参qRT-PCR引物的设计如下:

ATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG
TKGAPDH-qF 5' 3'
TKGAPDH-qR 5' AAAC 3'
2. 156bp ATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG
TKGAPDH-QF 5' GAGC 3'
TKGAPDH-QR 5' 3'