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DNA探针
—王艳慧
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什么是DNA探针
DNA探针是利用同位素、生物素等标记的特定DN***断,
该片断可大至寄生虫基因组DNA,小至20个碱基。
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原理
当DNA探针与待测的非标记单链DNA(或RNA)按碱基顺序互补结合时,以氢健将2条单链连接而形成标记DNA-DNA(或标记DNA-RNA)的双链杂交分子。将未配对结合的核苷酸溶解后用检测系统(放射自显影或酶检测等)检测杂交反应结果。
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优点
这类探针多克隆在质粒载体中,可以无限繁殖,取之不尽,制备方法简便。
DNA探针不易降解(相对RNA而言),一般能有效抑制DNA酶活性。
DNA探针的标记方法较成熟,有多种方法可供选择,如缺口平移法、随机引物法、PCR标记法等,能用于同位素和非同位素标记。
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双链DNA探针的合成方法
切口平移法
随机引物合成法
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切口平移法
当双链DNA分子的一条链上产生切口时, DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸,将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。
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切口平移反应受几种因素的影响
(a) 产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。
(b)DNA酶Ⅰ DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。
(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。
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注意
1、3H,32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记,但通常使用[α-32 P]-dNTP。
2、DNA酶Ⅰ的活性不同,所得到的探针比活性也不同,DNA酶Ⅰ活性高,则所得探针比活性高,但长度比较短。
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随机引物合成法
随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。
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