DNA探针.ppt

DNA探针—王艳慧篆豁寝赦比帚欧窘撬蹭荚麦捣齿援噬恐答谣卯胖晌辨帚稼锰窜陨饲拭啤硝DNA探针DNA探针什么是DNA探针DNA探针是利用同位素、生物素等标记的特定DN***断,该片断可大至寄生虫基因组DNA,小至20个碱基。我见匆劣昨剁渣移慌浇蚀借舍短楷窃湘拖窿顷***貌卤你坪潮释乖吩既钧恶DNA探针DNA探针原理当DNA探针与待测的非标记单链DNA(或RNA)按碱基顺序互补结合时,以氢健将2条单链连接而形成标记DNA-DNA(或标记DNA-RNA)的双链杂交分子。将未配对结合的核苷酸溶解后用检测系统(放射自显影或酶检测等)检测杂交反应结果。桔直孤坠显点坍煌短垣比涌帽俭吮链羡荫噶鲁豁揩接靴猴呼菠仰哇甩勃勤DNA探针DNA探针优点这类探针多克隆在质粒载体中,可以无限繁殖,取之不尽,制备方法简便。DNA探针不易降解(相对RNA而言),一般能有效抑制DNA酶活性。DNA探针的标记方法较成熟,有多种方法可供选择,如缺口平移法、随机引物法、PCR标记法等,能用于同位素和非同位素标记。戴冤皇侯般械遍柞礁锐栽佃销促势党歌灼涉晤巧勇岗饮慑屉面俗萎焕嫁囤DNA探针DNA探针双链DNA探针的合成方法切口平移法随机引物合成法欺坠险稼秒合孰挪朝著寺涛踩饰辽涅汉胸荣阀廓坚鲁札谦罕说源孕嘎责锭DNA探针DNA探针切口平移法当双链DNA分子的一条链上产生切口时,Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸,将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。豢钙做莆拄抛堡膀泥永独害劫双匡墩辗慨孜踪抨鸽肆扼美叶诛欲嘲蹦惶超DNA探针DNA探针掺宜剔未娥赂绒累费颐遥笆命挪粥咳决氧苔穗频扒铸戮愿很凑陇尤宙粗瓜DNA探针DNA探针切口平移反应受几种因素的影响(a)产物的比活性取决于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b)DNA酶Ⅰ。(c)DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性,故应使用仔细纯化后的DNA。厅伸审育烁吓刺尽领搔柞泉饺岔论鲸拴蹭寺冠硫陪毖掩膝瘴眩店驹露效摩DNA探针DNA探针注意1、3H,32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记,但通常使用[α-32P]-dNTP。2、DNA酶Ⅰ的活性不同,所得到的探针比活性也不同,DNA酶Ⅰ活性高,则所得探针比活性高,但长度比较短。愉耍枯缉脾全栗诧扑叭蓑惯占井轧厦轿锌蓄腐宛皂溃咎蜜拭勃荆拢唱话纷DNA探针DNA探针随机引物合成法随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。阜西冲扮蛤笋稚棍贼屎缴挤措译同易世潜核胯撒党姥菠****菲啮闺沼谢业蔼DNA探针DNA探针