嘌呤霉素说明书.docx

说明：蛋白质合成抑制剂。抑制细菌、藻类原生物和哺乳动物细胞生长。ﻫﻫ嘌呤霉素（Ｐｕrｏｍyciｎ)是由白黑链霉菌（Sｔreｐtomｙces ａｌboniger)发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素,通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌,各种动物和昆虫细胞。某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。作用机制在于嘌呤霉素是氨酰－tRNＡ分子3’末端的类似物,能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。嘌呤霉素同A位点结合后,不会参与随后的任何反应,从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出Ｃ-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。ﻫﻫ嘌呤霉素产生菌Ｓtreptomｙｃeｓ alｂoｎｉgｅr内发现的ｐac基因编码嘌呤霉素Ｎ－乙酰转移酶(PAC),赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。这一特性如今普遍应用于筛选特定携带paｃ基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。ﻫﻫ嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关,现在商业化的慢病毒载体多数都携带pａc基因。在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带ｐac基因质粒的大肠杆菌菌株。
ﻫ溶解性:溶于水,参考浓度50mｇ／ml。:１-１０ μｇ/ｍL,最佳浓度需要杀灭曲线来确定；ﻫﻫ大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌,使用浓度为１２５μｇ/ｍL。注:使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的ｐH值调节,而且受宿主细胞本身的影响。 ｍｇ/ｍｌ的母液, μm滤膜过滤除菌后分装于-２0℃冻存;也可溶于甲醇，配制成1０ mｇ/ｍl的储存液。ﻫﻫ3. 嘌呤霉素杀灭曲线的确定(以ｓｈＲNA转染或者慢病毒转导为例）ﻫﻫ嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关。为了筛选到稳定表达的shＲNA细胞株,确定杀死未转染／转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线（kilｌ ｃuｒｖe）。ﻫ
1) Day 1：24孔板内以５～8 x １０4 ｃｅlｌｓ/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。37℃细胞孵育过夜;ﻫﻫ２） Day 2:a)准备筛选培养基:含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如０-1５μｇ／ｍL,至少5个梯度)；b）往孵育过夜后的细胞内更换新鲜配制的筛选培养基;之后37℃孵育细胞;ﻫﻫ3） Day ４:更换新鲜的筛选培养基,并观察细胞存活率。ﻫﻫ４） 根据细胞的生长状态,约2-3天更换新鲜的筛选培养基;ﻫﻫ5) 每日监测细胞,观察存活细胞率,