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引物纯化方式选择指南
内容导读
一、DNA合成的方法和原理
二、引物纯化的方法原理及其效果
三、纯化方法与应用指南
四、常见问题的原因分析及相应的对策
2012-2-16 10:24:14
一、DNA合成的方法和原理
目前引物合成主要采用固相亚磷酰***三酯法进行。基于该方法的DNA合成仪有多种,由ABI/PE公司生产的高通量DNA自动合成仪得到了广泛的应用。各合成仪进行引物合成的原理基本相同,主要区别在于合成产率的高低、试剂消耗量和单个循环用时等。生工公司采用的合成仪主要机型为全新的ABI3900高通量合成仪。
固相亚磷酰***三酯法合成DN***段,具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的,DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5’→3’方向延伸,而是由3’端开始,相邻的核苷酸通过3’→ 5’磷酸二酯键连接。具体的反应步骤如图一。
1、脱保护基(Deblocking)
用三***乙酸(Trichloroacetic Acid,TCA) 脱去连结在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保护基团DMT (二甲氧基三苯***),获得游离的
5'-羟基端,以供下一步缩合反应。
2、活化(Activation)
将亚磷酰***保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱,形成亚磷酰***四唑活性中间体(其3'-端已被活化,但5'-端仍受DMT保护),此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。
3、连接(Coupling)
亚磷酰***四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时,将与其5'-羟基发生亲合反应,缩合并脱去四唑,此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。
4、封闭(Capping)
缩合反应后,为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后的循环反应中被延伸,常通过乙酰化来封闭此端羟基,一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-***咪唑等混合形成的。
图1: DNA合成原理示意图(固相亚磷酰***三酯法)
5、氧化(Oxidation)
缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接,而亚磷酯键不稳定,易被酸、碱水解,此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯,得到稳定的寡核苷酸。
经过以上五个步骤后,一个脱氧核苷酸就被连到CPG的核苷酸上,同样再用三***乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5'-羟基上的保护基团DMT后,重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即
可得到DN***段粗品。最后对其进行切割、脱保护基,合成的Oligo
在脱去保护基后,目的Oligo纯度是比较低的,其中含有大量的杂质。主要杂质有:所脱下的保护基与氨形成的苯甲酸氨和异丁酸氨,***磷基上脱下的***乙基,以及合成时产生的短链等。以至于粗产品中全长Oligo DNA含量仅为25%左右。尽管合成时每一步的效率都在98%~99%,但累积的效率并不高。这些杂质成分,尤其是存在于粗产品中的大量盐和短链,不但造成定量不准,还会影响下一步的反应。因此必须对Oligo DNA进行纯化、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。
二、引物纯化的方法原理及其效果
基于以上合成的原理和步骤,目前,常见的几种纯化方法如C18柱、OPC或HAP、PAGE、HPLC。生工公司采用HAP、ULTRA PAGE、HPLC三种纯化方法,其纯化的原理及其效果分别如下,我们建议客户应根据不同的实验需求,选择合适、经济并有效的纯化方法。
1. HAP纯化方法
HAP(HighAffinityPurification)是生工生物自主开发的新型oligoDNA纯化方法。该方法已取得国家专利(专利号:)。其原理是利用合成引物5'-端DMT基团对HAP树脂专一性吸附,而不含DMT的短链DNA不被吸附,从而达到分离纯化的目的。
HAP纯化柱中装有对 DMT 具有亲和力的树脂,合成DNA 片段时保留 5'端最后一个碱基上的 DMT,所有合成产物吸附在柱上以后,用稀的有机溶剂洗柱,带有 DMT 的片段吸附能力强,不易被洗脱,不带有 DMT 的片段吸附能力弱,被洗脱。然后用三***乙酸 TFA 或三***乙酸 TCA 脱去 DMT 基团,再用浓一点的有机溶剂洗脱 DNA。这种方法具有多快好省的特点。制品纯度可达到
80~90%,可以满足杂交探针、测序、常规PCR(不再做进一步克隆实验)等用途了。但是因为其专一性吸附 DMT 能力有限,不免仍然有短片段带入的可能,而且负载量小。特别是对长于39 碱基以上的片段纯化效果不好。此级别只提供长度在10-3