引物纯化方式选择指南.docx

内容导读
一、 DNA合成的方法和原理
二、 引物纯化的方法原理及其效果
三、 纯化方法与应用指南
四、 常见问题的原因分析及相应的对策
一、DNA合成的方法和原理
目前引物合成主要采用固相亚磷酰***三酯法进行。基于该方法的 DNA 合成仪有多种，由 ABI/PE 公司生产的高通量 DNA 自动合成仪得到了广泛的应用。 各合成仪进行引物合成的原理基本相同， 主要区别在于合成产率的高低、 试剂消耗量和单个循环用时等。 生工公司采用的合成仪主要机型 为全新的 ABI3900 高通量合成仪。
固相亚磷酰***三酯法合成 DNA 片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该
方法是在固相载体上完成 DNA链的合成的，DNA化学合成不同于酶促的 DNA合成过程从5'〜3' 方向延伸，而是由3'端开始，相邻的核苷酸通过 3't磷酸二酯键连接。具体的反应步骤如图一。
1、 脱保护基 (Deblocking)
用三***乙酸 (Trichloroacetic Acid ， TCA) 脱去连结在 CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保 护基团 DMT (二甲氧基三苯*** )，获得游离的 5'-羟基端，以供下一步缩合反应。
2、 活化 (Activation)
将亚磷酰***保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱， 形成亚磷酰***四唑活性中间体
(其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保护),此中间体将与 GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩 合反应。
3、 连接 (Coupling)
合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。
4、封闭 (Capping)
缩合反应后，为了防止连在 CPG上的未参与反应的 5'-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过
乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和 N-***咪唑等混合形成的。
图 1: DNA 合成原理示意图(固相亚磷酰***三酯法)
5、氧化 (Oxidation)
缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在 CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，
易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。
经过以上五个步骤后， 一个脱氧核苷酸就被连到 CPG的核苷酸上，同样再用三***乙酸脱去新 连上的脱氧核苷酸 5'-羟基上的保护基团 DMT 后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可 得到DN***段粗品。最后对其进行切割、脱保护基，合成的 Oligo在脱去保护基后，目的 Oligo
纯度是比较低的， 其中含有大量的杂质。 主要杂质有： 所脱下的保护基与氨形成的苯甲酸氨和异 丁酸氨，***磷基上脱下的***乙基，以及合成时产生的短链等。以至于粗产品中全长 Oligo DNA 含
量仅为25%左右。尽管合成时每一步的效率都在 98%〜99%，但累积的效率并不高。这些杂质成
分，尤其是存在于粗产品中的大量盐和短链， 不但造成定量不准， 还会影响下一步的反应。 因此 必须对 Oligo DNA 进行纯化、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。
二、引物纯化的方法原理及其效果
基于以上合成的原理和步骤，目前，常见的几种纯化方法如 C18柱、OPC或HAP、PAGE
HPLG生工公司采用 HAP、ULTRA PAGE HPLC三种纯化方法，其纯化的原理及其效果分别如下， 我们建议客户应根据不同的实验需求，选择合适、经济并有效的纯化方法。
HAP 纯化方法
HAP( HighAffinityPurification )是生工生物自主开发的新型 oligoDNA 纯化方法。该方法已取 得国家专利(专利号：)。其原理是利用合成引物 5'-端DMT基团对HAP树脂专一性吸附，而不 含DMT的短链DNA不被吸附，从而达到分离纯化的目的。
HAP纯化柱中装有对 DMT具有亲和力的树脂，合成 DN***段时保留 5'端最后一个碱基上
的 DMT ，所有合成产物吸附在柱上以后， 用稀的有机溶剂洗柱， 带有 DMT 的片段吸附能力强，
不易被洗脱，不带有 DMT 的片段吸附能力弱，被洗脱。然后用三***乙酸 TFA 或三***乙酸 TCA 脱去DMT基团，再用浓一点的有机溶剂洗脱 DNA。这种方法具有多快好省的特点。 制品纯度
可达到80〜90%,可以满足杂交探针、测序、常规PCR（不再做进一步克隆实验）等用途了。但 是因为其专一性吸附 DMT 能力有限， 不免仍然有短片段带入的可能， 而且负载量小。 特别是对 长于 39 碱基以上的片段纯化效果不好。 此级别只提供长度在 10-39mer 以下的合成 oligo DNA 制 品。序列更长时，制品的纯度得不到保证。若考虑节约经费