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分离肝癌细胞及其转移性细胞株的建立
【摘要】【目的】建立新的肝细胞癌细胞系,为肝癌实验研究提供更多纯化癌细胞。【方法】从肝细胞癌患者原发灶和门脉癌栓中获取癌组织,采用Percoll浓度梯度分离癌细胞进行培养,用微环境消化法获取癌细胞克隆并建立细胞系,对培养成功的细胞系进行生长曲线测定、染色体G带核型分析、对比基因组杂交和裸鼠接种成瘤实验。【结果】对20例肝癌组织进行癌细胞分离培养和克隆,成功建立2例细胞系H2M和H4M,这2株细胞均来自门脉癌栓,它们的染色体数目测定均为超3倍体(71~78条)。CGH检测显示H2M主要的细胞遗传学改变为染色体4q、13q、16q、17p和19p缺失和1q、3q、5p、6p、7q和8q扩增,其中有一条标记染色体含有1q和6p[t(1;6)染色体];而H4M染色体8p,9,13q,16q缺失和6p,7p,11p,11q13扩增,其中有一条标记染色体含有一长的均染区(hsr)。H2M细胞接种裸鼠1个月,产生典型的人肝细胞癌,但H4M接种尚未能成瘤。【结论】Percoll浓度梯度分离癌细胞和微环境消化法取得癌细胞克隆是建立原代细胞系的有效方法。2例肝癌细胞系的建立为以后肝癌研究提供了实验材料,所测出的肝癌细胞系的细胞遗传学改变及在裸鼠接种成瘤,为肝癌细胞癌基因和抑癌基因筛选提供了研究线索和实验模型。
【关键词】肝癌;细胞株;核型;比较基因组杂交
肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是常见癌症之一。尽管已有多个肝癌细胞系供实验室研究用,但这些细胞多由国外研究人员建立,而且极少从门脉转移灶建立[1]。此外,已建立的细胞系缺乏细胞遗传学改变的资料
,不能为肝癌癌基因、抑癌基因的筛选及肝癌转移机制研究提供线索。本文描述2例门脉转移性肝癌细胞系的建立过程并检测其分子遗传学改变,的深入研究提供实验工具。
1材料和方法

20例肝癌组织取自中山大学附属第一医院肝胆外科手术标本,每份癌组织均取原发灶和门脉癌栓,经病理检查证实和进行细胞培养。


培养数天后,通过微环境消化法获取癌细胞克隆。具体方法如下:先将细胞稀释传代,待细胞生长2~3d,然后在倒置显微镜下对单个分散存在的癌细胞克隆位置在平皿底部用油性笔定位标记。将培养液吸去,íTA的消化液预消化。用一弯头管口平整的玻璃吸管吸取约10?滋L的消化液,让消化液保持在吸管口处,将吸管口置于所标记的细胞克隆上面,吹出微量的培养液,随即将培养液重新吸回吸管。将含细胞的消化液置入24孔培养板内,加入约1mL的培养液继续培养。待细胞增多时再进行扩大培养。
采用这种方法,成功培养2例男性肝癌患者的肝癌细胞系,2例均取自门脉癌栓,分别命名为H2M和H4M。

×104接种在直径5cm的塑料平皿,于接种后第2天开始将细胞消化计数,每天消化3个平皿的细胞数并计算平均
值,连续7d,最后绘制细胞生长曲线和倍增时间。H2M采用第16代细胞,接种密度为7×104每平皿,计算方法同上。

?滋g/ml的秋水仙素,继续培养3h,胰酶消化收获细胞,