RT-PCR的实验原理与操作步骤.docx

提取组织或细胞中的总RNA以其中的mRN作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCF使测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA羊品分析成为可能。该技术主要用于:分析基因的转 录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。(一) 反转录酶的选择Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶:有强的聚合酶活性,RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37C。禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶:有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42C。Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶:在Mn2存在下,允许高温反转录RNA,以消除RNA模板的二级结构。MMLV反转录酶的RNaseH-突变体:商品名为SuperScript和SuperScriptU。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA,这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。(二) 合成cDNA引物的选择随机六聚体引物:当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时,可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时,体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板,PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。Oligo(dT):是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3'端Poly(A)尾,此引物与其配对,仅mRNA被转录。由于Poly(A)RNA仅占总RNA的1-4%,故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。特异性引物:最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物,若PCR反应用二种特异性引物,第一条链的合成可由与 mRNA3'端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA,导致更为特异的PCR扩增。生物科研、 "target="_blank">RNA :含dATP、dCTP、dGTP、、 实验步骤总RNA的提取见相关内容。cDNA第一链的合成目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTMPreamplificationSystemforFirstStrandcDNASynthesis 试剂盒为例。,加入总RNA1-5卩g,补充适量的DEPCH2O使总体积达11卩l。在管中加0卩MOligo(dT)12-181卩l,轻轻混匀、离心。70C加热0min,立即将微量离心管插入冰浴中至少 1min。然后加入下列试剂的混合物:10xPCRbuffer 2卩125mMMgCl2 2卩110mMdNTPmix 2卩1轻轻混匀,离心。 42C孵5min。加入Superscriptn1在l42C水浴中孵育50min。于70°C加热15min以终止反应。将管插入冰中,加入RNas