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广西师范大学
硕士学位论文
罗汉果蛋白酶的分离纯化及性质研究
姓名:刘国雄
申请学位级别:硕士
专业:有机化学
指导教师:苏小建
20070101
广西师范大学硕士研究生学位论文
罗汉果蛋白酶的分离纯化
及性质研究
年级:2004 级学院:化学化工学院专业:有机化学
研究方向:天然产物化学研究生:刘国雄导师:苏小建高工
中文摘要
罗汉果(Siraitia grosvenorii)是我国特有的植物,主产于广西桂林,在医药、
食品、保健等方面应用广泛,在国内外市场都受到极大的欢迎。但目前对罗汉果
的加工利用仅仅局限于果实中少数几种成分,而其它许多有用成分并没得到充分
利用,这既浪费了资源又给环境造成很大污染。此外,蛋白酶是目前工业用酶的
三大主要酶制剂之一,在食品、化工、医疗、制药等方面应用广泛。而有限的蛋
白酶源与逐年上升的市场需求相比已呈紧缺之势,因此有效地开发新的蛋白酶源
已经迫在眉睫。
本论文在前人研究的基础上进一步对罗汉果蛋白酶的分离纯化、性质、应用
以及提取工艺等方面进行了深入的研究,以便更全面地了解罗汉果蛋白酶的结
构、性质和特点,为开发新的蛋白酶源和有效地综合利用我国特有的罗汉果资源
提供一定的科学依据。现将研究结果总结如下:

一、罗汉果蛋白酶的分离纯化
以鲜罗汉果为原料,经洗净,去皮,粉碎,匀浆,离心去渣,得罗汉果汁,再经
50%饱和度硫酸铵盐析,沉淀透析,冷冻干燥得罗汉果粗酶。粗酶通过 CM
Sepharose FF 离子交换、Sepahcryl S-200 HR 凝胶过滤、Sepahcryl S-100 HR 凝胶
过滤柱层析分离,得到纯化的罗汉果蛋白酶,再将其进行 SDS-PAGE 和凝胶过
滤 HPLC 分析均显示单一的蛋白质条带或蛋白质峰。纯化后蛋白酶的酶比活为
×107U/g,与果汁相比蛋白酶活性回收率为 %,提纯倍数为 31 倍。

二、罗汉果蛋白酶的性质研究
由分离纯化得到的蛋白酶,经凝胶 HPLC 测定其纯度在 98%以上,SDS-PAGE
和 Sephacryl S-100 凝胶过滤柱层析测定蛋白酶的相对分子质量分别约为 37100D
和 38200D。蛋白酶的活性在 pH12 时最大,可将该酶归类为碱性蛋白酶。紫外
光谱显示酶在 220nm 和 280nm 处有强吸收,推测在酶分子中可能存在含苯环侧
链的氨基酸残基。其它酶活性测定显示该酶不具有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、过
氧化物酶、淀粉酶及脂肪酶活性。此外,大豆胰蛋白酶抑制剂不能抑制该蛋白酶
的活性,这也说明该蛋白酶不属于胰蛋白酶。
I
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为了探索罗汉果蛋白酶活性所必需的氨基酸侧链基团,实验用对不同的氨基
酸残基有专一性作用的各种化学修饰剂与罗汉果蛋白酶反应,结果显示羟基、吲
哚基和咪唑基的修饰对罗汉果蛋白酶活性有很大的抑制作用。进一步用酪蛋白作
底物保护蛋白酶中的羟基、吲哚基和咪唑基,以使它们不被修饰,结果显示蛋白
酶活性与保护前的酶活性相比有很大的提高。由此确定羟基、吲哚基和咪唑基参
与了罗汉果蛋白酶和酪蛋白底物的结合,为罗汉果蛋白酶的活性必需基团。

三、金属离子、化学试剂和表面活性剂对蛋白酶活性的影响
在常见金属离子中,Cu2+ 对蛋白酶活性影响最大,5mmol/L 的 Cu2+能使酶
活性降低到原来的 %,此外 Al3+、Ni2+、Mn2+也能部分抑制该酶的活性,而
其它金属离子对酶活性没有大的影响,相反 Fe3+和 Mg2+能激活酶的活性。
%的 SDS 和 %的 Triton X-100、吐温 80、聚乙二醇和乙二醇对有酶
活性有不同的抑制作用,其中 %Triton X-100 对该酶活性影响最大,作用后
活性仅保留 57%;Na2B4O7·10H2O 对酶活性有很大的增强,作用后使酶活性提高
倍,其它常见化学试剂和表面活性剂或增稠剂对酶活性没有明显的影响。

四、罗汉果蛋白酶的对其它蛋白质的水解作用和储存稳定性研究
实验结果显示,与对酪蛋白有很好的底物专一性相比,罗汉果蛋白酶几乎不
水解牛白蛋白、卵蛋白和胰蛋白,但对明胶、溶菌酶有一定的水解活性。
罗汉果蛋白酶的稳定性研究表明,干燥、避光、低温储存和质量分数为 1%
半胱氨酸的添加都有利于罗汉果蛋白酶的稳定,20%的葡萄糖对储存三个星期后
罗汉果蛋白酶的稳定有很好的保护作用。EDTA 对罗汉果蛋白酶活性有一定抑制
作用,但在储存 75 天后对酶活性有