蛋白质组学实验方法.doc

2、蛋白质分离的双向电泳过程

常用水化上样缓冲液
(Ⅰ)
尿素 8M
CHAPS 4%
DTT 65Mm
Bio-Lyte %(w/v) 50μl(40%)
溴酚蓝 % 10μl(1%溴酚蓝)
MilliQ水定容至100ml
(Ⅱ)
尿素 7M
硫脲 2M
CHAPS 4%
DTT 65Mm
Bio-Lyte %(w/v) 50μl(40%)
溴酚蓝 % 10μl(1%溴酚蓝)
MilliQ水定容至100ml
(Ⅲ)
尿素 5M
硫脲 2M
SB3-10 2%
CHAPS 4%
DTT 65Mm
Bio-Lyte %(w/v) 50μl(40%)
溴酚蓝 % 10μl(1%溴酚蓝)
MilliQ水定容至100ml
分成10小管,每小管1ml,-80℃冰箱保存。
胶条平衡缓冲液母液
尿素 6M 36g
SDS 2% 2g
Tris-HCl ( Tris-HCl)
甘油 20% 20ml
MilliQ水定容至100ml
分装成10管,-20℃冰箱保存。
胶条平衡缓冲液Ⅰ
胶条平衡缓冲液母液 10ml
DTT
充分混匀,用时现配。
胶条平衡缓冲液Ⅱ
胶条平衡缓冲液母液 10ml
碘乙酰***
充分混匀,用时现配。
低熔点琼脂糖封胶液
低熔点琼脂糖 %
Tris 25mM
甘氨酸 192mM
SDS % 1ml(10%SDS)
溴酚蓝 % 100μl(1% 溴酚蓝)
MilliQ水定容至100ml
加热溶解至澄清,室温保存。
30%聚丙烯酰***贮液
丙烯酰*** 150g
甲叉双丙稀酰*** 4g
MilliQ水 500ml
滤纸过滤后,棕色瓶4℃冰箱保存。

Tris碱
MilliQ水 400ml
用1mol/L ,加MilliQ水定容至500ml, 4℃冰箱保存。
10% SDS
SDS 10g
MilliQ水 100ml
10%过硫酸铵
过硫酸铵
MilliQ水 1ml
现用现配。
10×电泳缓冲液
(1×=25mM Tris,192mM glycine,% SDS,)
Tris碱 30g
甘氨酸 144g
SDS 10g
MilliQ水 1L
混匀后,室温保存。

第一向等电聚焦
,室温溶解;在enpendoff管中,,室温下裂解3-4h;10000rpm常温离心10min,取上清液上样水化。具体的上样体积及蛋白质上样量如下表,
ReadyStripTMIPG胶条长度
上样体积
分析型的上样量
(银染)
制备型的上样量
(考马斯亮兰染色)
7cm
125-250μl
10-100ug
200-500ug
17cm
300-600μl
100-300ug
1-3mg
-20℃冷冻保存的IPG预制胶条,于室温放置10min。
。在槽两端各1cm左右不要加样,中间的样品一定要连贯,同时注意不要产生气泡。
,分清胶条的正负极,轻轻地将IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液上,使得胶条得正极对应于聚焦盘得正极。确保胶条与电极紧密接触,同时不要使胶条下面的溶液产生气泡。
,防止胶条水化过程中液体的蒸发。
、负极,盖上盖子。设置等电聚焦程序。
7cm胶条
水化 12h(17-20℃) 主动水化
S1 250V 慢速 2 h 除盐
S2 500V 慢速 1 h 除盐
S3 1000V 快速 1 h 除盐
S4 4000V 线性 3 h 升压
S5 4000V 快速 25000 伏h 聚焦
S6 500V 快速任意时间保持
17cm胶条
水化 12h(17-20℃) 主动水化
S1 250V 慢速 2 h 除盐
S2 500V 慢速 1 h 除盐
S3 1000V 快速 1 h 除盐
S4 8000V 线性 5 h 升压