实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥.pptx

选择标记基因与报告基因
必备条件:
编码一种不存在于正常植物细胞中的酶
基因较小
能在转化体中得到充分表达
检测容易,并且能定量分析
选择标记基因与筛选标记基因:
npt-II 新霉素磷酸转移酶基因(卡那,新霉素,G418),aat(链霉素,壮观霉素),spe(壮观霉素),strl(链霉素),cat(***霉素),bar(草苷膦)
报告基因:report gene(筛选标记之一)
在转化系统中通过瞬时及稳定表达检测来确定转化的DNA顺序(基因)是否能在转化细胞中得到表达,起到报告的作用。
gus基因(β-葡萄糖苷酸酶基因),gfp(绿色荧光蛋白基因)
转化目的基因可以省略附加的报告基因,但选择标记基因是不可缺少的。
植物基因转化受体
高效稳定的再生能力
较高的遗传稳定性
具有稳定的外植体来源
对选择性抗生素敏感
对农杆菌侵染有敏感性
植物基因转化受体系统类型:
愈伤组织再生系统
直接分化再生系统
原生质体再生系统
胚状体再生系统
生殖细胞受体系统
植物遗传转化方法
植物遗传转化
农杆菌介导法
基因枪法
PEG诱导原生质体
电穿孔法
操作简单,易造成原生质体损伤
双子叶植物
无宿主限制,技术限制
原生质体培养
转基因方法
农杆菌侵染法
基因枪法
农杆菌侵染法
农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系
对单子叶植物不敏感
根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒,其上有一段T-DNA,农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将T-DNA插入到植物基因组中。
T-DNA整合植物基因组的分子机理
T-DNA在植物染色体中的插入是随机的,可插入任何一条染色体。
插入位点特点:
T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点
T-DNA与植物DNA连接处富含A-T碱基对
植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性。
但在T-DNA的整合过程中常有植物基因组靶序列的缺失、倒位和重复等现象,T-DNA的整合一定程度上依赖于植物内源重组系统。
总之,T-DNA的整合是通过植物靶DNA和T-DNA间短的同源区段发生重组而完成的,在接口附近伴有DNA顺序的转换和重复。
真空浸透法转化拟南芥
受体材料
拟南芥种子消毒与萌发,播种后生长出现花蕾后打顶,待侧枝长出花蕾后,侵染前一天去除已开花蕾和果荚
接种
接种含有表达载体的农杆菌GV3101克隆于5 mL YEP液体培养基(Rif 100 μg/mL,Kan 50 μg/mL)中,28 °C,200 rpm振荡培养过夜
活化
将过夜培养的菌液按照1:100的比例转接到50 mL新鲜配制的YEP液体培养基(Rif 100 μg/mL,Kan 50 μg/mL)中,28 °C,200rpm振荡过夜培养至菌液OD600为1-2
诱导
收集菌体,重悬于浸染缓冲液(1/2MS,5%蔗糖,% Silwet L-77),-
转化
将拟南芥花蕾倒置于装有花浸染缓冲液的烧杯中,烧杯放置在真空罐中, min
培养
将拟南芥植株平放在拖盘中,盖上塑料膜,避光培养。1~2 d后去除塑料膜,培养至种子成熟
农杆菌侵染瞬时转化烟草
接种
接种含有表达载体的农杆菌GV3101克隆于5 mL YEP液体培养基(Rif 100 μg/mL,Kan 50 μg/mL)中,28 °C,200 rpm振荡培养过夜
活化
将过夜培养的菌液按照1:100的比例转接到50 mL新鲜配制的YEP液体培养基(Rif 100 μg/mL,Kan 50 μg/mL)中,28 °C,200 rpm振荡培养至菌液OD600为1-2
诱导
5000 rpm离心5 min收集菌体,重悬于浸染缓冲液(1/2MS,5%蔗糖,乙酰丁香***120µmol/L),-
侵染
烟草组培苗叶片切成小块,浸泡在菌液中侵染10min后,用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液,置于共培养培养基(MS+5%蔗糖+乙酰丁香***120µmol/L)上(25±2)℃暗培养条件下培养2d。
注射法瞬时转化烟草
受体材料
种植本生烟(Nicotianabenthamiana):25 °C,16 h光照,约一个月后可用;在注射的前一天将烟草浇水并置于黑暗条件下;
接种与活化
小量培养农杆菌16-24 h;按1:100转接到培养液(5 mL YEP,100 µM乙酰丁香***(Aldrich),10 mM MES(pH ),Rif 100 μg/mL,Kan 50 μg/mL)中,28 °C16-24 h
诱导
,5 000 rpm 10 min收集菌体,用溶