流式细胞仪操作规程.doc

FACSCalibur流式细胞仪操作规程
一、编号:YQ0606
二、标题:FACSCalibur流式细胞仪操作规程
三、关键词:流式细胞仪操作规程
四、目的:保证流式细胞仪的安全及有效操作
五、背景知识:流式细胞术(Flow CytoMeter,FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段,它可高速分析上万个细胞,并能同时从一个细胞中测得多个参数,与传统荧光镜检查相比,具有速度快、精度高、准确性好等优点,成为当代最先进的细胞定量分析技术。
六、原理
待测细胞染色后制成单细胞悬液,用一定压力将待测样品压入流动室,不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出,鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度,这样鞘液就能够包绕着样品高速流动,组成一个圆形的流束,待测细胞在鞘液的包被下单行排列,依次通过检测区域。
流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束,垂直照射在样品流上,被荧光染色的细胞在激光束的照射下,产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测,这种信号基本上反映了细胞体积的大小;荧光信号的接受方向与激光束垂直,经过一系列双***反射镜和带通滤光片的分离,形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度,经光电倍增管接收后可转换为电信号,再通过A/D转换器,将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理,将分析结果显示在计算机屏幕上,液可以打印出来,还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达,其X轴为测量强度,Y轴为细胞数目。一般来说,流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数,这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据,既可以单独显示每个参数的直方图,也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。
细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体,充电后振动,使喷出的液流断裂为均匀的液滴,待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷,当液滴流经带有几千伏特的偏转板时,在高压电场的作用下偏转,落入各自的收集容器中,不予充电的液滴落入中间的废液容器,从而实现细胞的分离。
七、仪器和材料:FACSCalibur流式细胞仪,染色好的单细胞悬液
八、操作步骤
(一) 开机程序
,打开电源,稳定5分钟。
,倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至4/5满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFlow),合上压力阀。确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置。
,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY,预热5-10分钟。排出过滤器内的气泡。
,打开打印机电源。
,等待屏幕显示出标准的苹果标志。
,以排除Flow cell中的气泡。
,先用FACAFlow或PBS进行HIGH R