2020版：中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识(完整版).pdf

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应建立完整的核酸检测流程(样本采集,样本前处理/核酸抽提及文库建立,质量控制及生物信息分析,二代测序结果的实验室判读)(A,Ⅲ)。推荐意见15:每批次实验中都应包括内参照、阴性对照品和阳性对照品。每批次实验均需严格评估是否存在操作或环境带来的污染。单个样本测序数据量特异性序列片段数建议不低于2×107条(即20M特异性序列数),此外建议测序序列读长不少于单端50bp(A,Ⅲ)。推荐意见16:对数据进行分析时,建议采用临床应用级别的数据库,审慎使用公共数据库(A,Ⅲ)。推荐意见17:建议二代测序检测病原体的报告应涵盖该批次实验中的内参照、阴性对照品和阳性对照品结果,并记录相关质量控制标准,如单个样本数据量、序列读长,以及相关的质控参数(A,Ⅲ)。(一)样本采集针对患者感染部位的不同,采集的样本类型主要包括静脉血、脑脊液、痰液、肺泡灌洗液、胸腔积液、腹水、组织、咽拭子、局灶穿刺物等多种类型。不同类型的样本采集需遵循以下原则:①对于无菌体液,如静脉血、脑脊液、胸腔积液、腹水等,需按照严格的无菌操作采集样本,采集前对局部或周围皮肤进行消毒处理,消毒液需与皮肤作用一定时间,待皮肤干燥后再取样,一般收集第2管标本送检。采集的样本须置于无菌容器内。②对于有菌部位的样本,如痰液、肺泡灌洗液、咽拭子等,应标明样本的:..扰后续检测结果。采集的样本应尽量选取感染部位的体液或组织,可提高检测结果的可信度。若感染部位的样本采集难度较大,可选择外周血液标本,但有可能会降低检测结果的准确性[25]。所有采集的感染部位样本均应及时送检。标本远距离运输需采用冷链运输,并保证无菌原则。应严格遵守相应测序厂商的运输标准作业程序(standardoperationprocedure,SOP),尽可能避免冻融环节。对于不能及时送检的样本,应按照前述各个标本的相应要求进行保存[26]。二)样本前处理/核酸抽提及文库建立不同样本类型均来源于疑似感染部位,具有潜在的感染性,在样本处理前需进行灭活处理。对于痰液样本,由于本身黏性较高,为方便后续实验操作,灭活后还需进行液化处理;对于血液样本,需根据实际检测需求决定是否离心进行血浆分离;对于组织样本,为提高核酸提取效率,需预先将其切碎后进行操作。所有的检测样本均来自人体的不同部位,因此在样本中本身就包含了大量人源细胞(或人源基因组/转录组成分),而且不同类型的样本中人源细胞(或人源基因组/转录组成分)含量也不一致,为提高检测结果的灵敏性,在不影响样本中病原体含量的前提下,可通过差异离心法或过滤等选择性地去除部分人源细胞(或人源基因组/转录组成分)。不同部位的样本经过处理后都要进行核酸提取,核酸的质量是决定二代测序成功的关键,因此不同实验室应建立完整的核酸检测流程,通过测:..对核酸样本有严格要求,需对每次提取的核酸样本进行定量检测,以确保核酸量满足后续实验要求。针对不同样本类型对提取的核酸进行文库制备,文库制备流程一般包括核酸片段化、末端修复、标签接头连接和PCR文库等。提取试剂盒及全流程中各种试剂的选择,都应考虑生产过程中的工程菌和环境污染微生物的核酸残留信息,以及对检测所造成的影响。在操作过程中应严格采取无菌流程,污染防控对标本结果的质量控制至关重要。每批次实验中都应包括内参照、阴性对照品和阳性对照品,以评估每批次样本中是否存在操作或环境带来的污染以及检测流程是否存在异常。三)质量控制及生物信息分析质量控制体系应包含多个质量控制点,依次为样本运输温控、提取浓度与纯度、出库浓度、文库片段分布、下机总数据量、测序质量(Q20、Q30比率)等,分别监控运输温度、核酸提取、文库构建、下机数据可靠性等方面,任何不符合质量控制标准的检测都应及时终止,重新检测,或在无法重新检测的情况下可提供预警,以供临床参考。全流程的质量控制标准应包含但不限于如下几项:①每批次实验中都应包括内参照、阴性对照品和阳性对照品。②在缺乏有效的人源宿主去除步骤的情况下,建议单个标本测序数据量特异性序列片段数不低于2×107条(即20M特异性序列数)。③为确保序列比对的准确性,避免因同源错配导致的序列比对错误,建议测序序列单端读长不少于50bp。目前,国际上采用的二代测序仪也可进行双端测序,但双端测序所花费的经济成本:..荐。推荐采用临床应用级别的数据库,对临床病原体的不同种、不同型别有满足需求的区分度。生物信息分析流程应有统一标准,以自动化为主,以人工纠错为辅,不应带有过多的人工判读成分。建议二代测序检测报告应涵盖该批次实验中的内参照、阴性对照品和阳性对照品结果,并记录相关质量控制标准,如测序质量、单个样本数据量、序列读长、检出病原微生物序列数、相对丰度等。四)二代测序结果的实验室判读推荐目前,不同的测序平台其二代测序病原体检测的判读阈值可能不同,但是应建议将下列标准用于所有二代测序病原体检测流程。满足三)质量控制及生物信息分析中质量控制标准的下机数据,在进入分析解读流程后应遵循以下原则:①剔除试剂、环境、测序和生物信息分析流程中引入的假阳性病原体信息,将样本中含有的病原体核酸信息真实地呈现给临床。②原则上报告病原体信息应准确到种(检出序列数极少或极高相似度的病原体复合群除外),同时应包含相应的属信息。③建议根据病原体出现的频度和临床致病性等信息,将临床高度关注、健康人样本中极少出现的病原体核酸信息单独呈现(即高度致病可能性),同时将某些部位(如呼吸道、皮肤、肠道等)的常见、低(或无)致病性病原体(定植菌等)单独呈现。④建议对报告中呈现的所有病原体引用权威文献进行关键信息的注释,以便临床能快速做出判断。报告中应有适度的微生物相关信息及相关文献帮助临床医师理解报告结果。四、二代测序结果的临床应用建议及其临床判读、验证:..感染和呼吸道感染在内的各部位感染均有一定的临床应用价值。在某些临床场景中,二代测序不仅有助于进行快速、精准的诊断,而且也对制订抗感染治疗方案及后续疗效评估具有指导作用。2016年,美国食品与药品监督管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)发布了二代测序体外诊断产品的指南草案;2018年,二代测序被写入《中国***医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南(2018年版)》[27];2019年,关于二代测序的《宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识》发布[25]。18:二代测序结果应在与患者临床表现及实验室检查密切结合的前提下进行解读和验证(B,Ⅲ)。推荐意见19:对于疑似中枢神经系统、血流、呼吸道感染或需排除感染性疾病的患者,根据推荐意见1至13采集合适的样本进行二代测序,根据送检样本类型结合患者的临床表现及其他结果辅助判断或排除诊断,同时应注意排除检出病原体定植的情况(B,Ⅱ)。2014年,有基于二代测序对1例中枢神经系统钩端螺旋体感染病例进行临床诊断的报道[6]。随后全球范围内陆续报道了通过对脑脊液及脑组织进行二代测序检测而确诊的中枢神经系统感染病例,其病原谱包括病毒、细菌、真菌、寄生虫等[28,29,30]。一项前瞻性研究纳入10例中枢神经系统神经炎症患者,对其脑组织进行二代测序检测,除了协助3例明确病原学诊断外,还提示二代测序阴性结果有助于排除感染性疾病的诊断[31]。另一项系统综述通过检索25篇论文共对44例以二代测序为诊断方法的疑:..16例同时可通过PCR等方式确诊,另外28例则为其他检测方法难以明确诊断的新发或少见/罕见病原菌感染病例,提示二代测序可协助临床疑难感染的诊断[8]。还有一项研究以健康志愿者为阴性对照,对78例脓毒症患者的血浆进行二代测序检测,检出病毒阳性15例,细菌及真菌阳性17例;提示二代测序联合血培养较单用血培养可显著提高病原体的检出率[32]。而对于呼吸道感染,相关研究主要集中在病毒所致感染。2015年,研究发现低覆盖度(<1M特异性序列数)二代测序对鼻咽拭子的病毒检出率虽然低于反转录PCR,但其有助于确定病毒亚型和血清型,也说明了测序数据覆盖度的重要性[33]。二代测序在缩短诊断周转时间方面也具有一定优势[34]。我国一项对178例重症肺炎患者的回顾性研究结果提示,二代测序可帮助进行早期病原学诊断,指导抗菌药物的应用,从而降低患者的病死率[35]。20:对于二代测序结果为阴性,但根据其他辅助检查结果(如培养结果)高度提示感染可能的尚不能排除感染的患者,建议必要时再次取样重复二代测序检测(B,Ⅱ)。若二代测序结果符合患者的临床表现和其他实验室检查,推荐根据二代测序结果指导临床决策。若患者二代测序结果阳性且符合临床表现,但缺乏除二代测序结果外的其他实验室支持证据,应进行PCR验证(在具有合适引物的条件下),并建议临床进一步完善可获得的传统实验室检查加以验证。若患者二代测序结果阳性,但临床表现或实验室检查结果不支持该结果,则不能仅根据二代测序结果进行诊断,而应以传统实验室检查结果为首要临床参考依据。对于二代测序结果为阴性,但根据其他辅助检查结:..(如培养结果)高度提示感染可能的尚不能排除感染的患者,建议必要时再次取样重复二代测序检测。推荐意见21:在中枢神经系统感染中,目前证据提示二代测序检测细菌、寄生虫、病毒的效果较好,而中枢神经系统真菌感染仍需更大样本量的临床试验来检验其检测效能(B,Ⅱ)。由于二代测序在中枢神经系统感染中的应用仍以病例报道为主,所以可参考的大型研究较少。脑脊液通常含有较低的病原体量,故病原体检测更具挑战性。在5项关于脑脊液的二代测序研究中,诊断率分别为0(0/36)、%(2/125)、6%(4/62)、19%(3/16)和30%(3/10)[36,37,38,39,40],在无细胞的脑脊液上清液中只能检测到无细胞病毒或无细胞微生物核酸,会导致较低的检出率,提示临床应采用脑脊液而非上清液作为二代测序标本[8]。国外一项研究显示,与传统临床实验室检查结果比较,二代测序的灵敏度为73%,特异度为99%,阳性预测值为81%,阴性预测值为99%[2]。另一项前瞻性研究对脑膜炎、脑炎和(或)脊髓炎患儿中收集到的20份脑脊液阳性样本进行二代测序检测,与传统的脑脊液微生物检测相比,二代测序检测诊断致病病原体的灵敏度为92%,特异度为96%[9]。我国患儿的脑脊液测序数据显示,%的二代测序检测结果与临床传统方法学一致,其中主要的病原体为细菌[30]。另一项研究发现在疑似中枢神经系统感染的初治患者中,与培养相比,二代测序具有90%的灵敏度,其检出率较培养提高了约25%[41]。已有的研究结果提示二代测序检测细菌、寄生:..验来验证其检测效能。22:对于脓毒症患者,推荐联合采用传统实验室培养和二代测序来提高病原学的检出率(B,Ⅱ)。血流感染的异质性较大,目前尚缺乏针对血流感染者的大型二代测序诊断效能研究。现有的研究结果提示,血液样本二代测序与血培养保持了高度的一致性,是可靠的病原学检测方法。一项中国的研究显示,以培养为金标准,%%;此外,二代测序还表现出了比血培养更高的额外检测效能,成为血培养的有力补充[32]。若以培养联合二代测序、桑格法测序验证作为金标准,则二代测序的阳性率较单用血培养有显著提升(%%)[32]。另一项关于脓毒症休克的研究中,二代测序的阳性率在起病前3周内波动于71%左右,而血培养阳性率仅在起病时达33%,此后波动于10%~20%[42]。推荐意见23:对于局灶脓肿或组织感染患者,二代测序的总体灵敏性和特异性均较好,其中对细菌检测的灵敏性优于真菌(A,Ⅱ)。在关于局灶性感染的病原体检测报道中,个案报道较多。但已有研究证实,二代测序在包括局灶脓液、感染部位组织、感染性的体液标本中的灵敏性均优于传统实验室检测。在骨关节感染中,二代测序与临床培养阳性标本的一致率可达83%~%,%~93%的病原体[43,44]。肺组织二代测序对细菌感染的灵敏度可达100%,%;%,%;:..%%,阴性预测值分别为100%%[45]。24:对于呼吸道感染,二代测序在病毒及少见病原体的检测中体现出较好的检测效能;但在细菌、真菌等病原体的检测中,二代测序尚不能准确判断菌群定植或感染状态,仍需依赖临床医师结合患者病情进行进一步分析(A,Ⅱ)。推荐意见25:对于结核分枝杆菌、伤寒沙门菌、布鲁菌等胞内菌,以及具有细胞壁的真菌,二代测序的检测效能会相对降低,应对上述菌群设置特定的序列数阈值(A,Ⅲ)。在二代测序检测呼吸道病原体的研究中,一项研究对67份儿科呼吸道感染患者的鼻咽拭子标本同时进行了多重PCR和二代测序检测,两者的一致率为93%;二代测序漏诊了其中3例,但多重PCR同样未检测到其中2例患者感染的病毒;同时,二代测序检测到了PCR靶向范围外的11株病毒[46]。在***上呼吸道感染领域,一项研究探索了二代测序在89份***急性上呼吸道感染鼻咽拭子标本中的应用,%,%~%;在二代测序漏诊的标本中,相应病原体的实时PCR循环阈值显著更高,提示病原体载量低,在低数据量覆盖度的情况下可能影响二代测序的检出率[33]。另一项研究评估了二代测序在24份流行性感冒病毒阳性的呼吸道标本(包括肺泡灌洗液、痰液和咽拭子)中的检测性能;24份标本中,18份的二代测序结果与PCR完全一致,另外6份不一致的标本中,病毒实时PCR循环阈值均高于35[47]。还有研究将二代测序应用于16例急性下呼吸道感染患者的鼻咽抽吸物标:..15份标本中都检出了病毒,结果与PCR完全一致[48]。在重症肺炎患者中,%,且二代测序有更高的灵敏度[35]。综上所述,目前已发表的关于二代测序应用于临床标本的检测效能研究发现,当样本中病原微生物含量较高时,二代测序的总体检测效能与PCR差距不大;但当病毒载量较低时,当前二代测序(20M左右特异性序列数)会出现假阴性,在灵敏度方面不如PCR,需要通过进一步增加数据量来提高检测灵敏度。二代测序可对不明、少见、不典型病原体进行检测。一项中国的研究对561例患者(其中呼吸道感染255例)的各种标本行二代测序检测(其中肺泡灌洗液+痰标本共292份);结果提示与培养相比,二代测序对结核分枝杆菌、厌氧菌、真菌的检出率均显著高于培养;以临床诊断为金标准,二代测序比培养显著提高了灵敏度(%%),而特异度无显著区别[24]。另一项研究对13例诊断为社区获得性肺炎的免疫抑制患者进行二代测序检测,结果二代测序和培养都检测到5株阳性细菌;但是在真菌检测方面,二代测序对肺孢子菌的灵敏度明显高于培养[49]。在临床应用中,对于结核分枝杆菌、伤寒沙门菌、布鲁菌等胞内菌,以及具有细胞壁的真菌,二代测序的检出效能会相对降低,应对上述菌群设置特定的序列数阈值或结合捕获技术以提高测序数据的覆盖度[24,50]。综上,在呼吸道有菌环境下的二代测序结果的判读尚无统一标准。关于二代测序应用于细菌、真菌检验效能的研究尚不多。目前的数据提示与培养相比,二代测序能显著提高灵敏度。但对于结核分枝杆菌等病原体,与临床诊断相比,二代测序的诊断还需更多探索。:..26:对于新发、罕见、疑难感染性疾病,以及免疫缺陷患者,二代测序能显著提高病原体的检出率,可作为上述疾病的一线检测手段(A,Ⅲ)。虽然二代测序检测成本高,但其在免疫缺陷患者和重症患者的病原学诊断中体现出较高的临床应用价值[51