食蟹猴的p4502e1药物代谢酶及其与食蟹猴p450氧化还原酶的共表达重组载体的制作方法.docx

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CA法测定蛋白含量,用一氧化碳结合法测定P450含量;将上述微粒与系列稀释的***唑沙宗混合物置于反应管中,同时加入相应量的NADPH-细胞色素P450氧化还原酶,水浴。力n40pL10mMNADPH溶液启动反应。,混匀后置于冰水;上述各反应管离心,取上清加入到96孔,样板,联^ig用HPLC和LC-MS测定代谢物的生成或减少,M^l实验方法,定量分析和数据处理,计算得到昆虫细胞重组表达的食蟹猴P4502E1代谢***唑沙宗的活性,使其酶活指标Km和Vmax值处于理想范围,通过食蟹猴P4502E1有效的代谢***唑沙宗的可以产生6,-羟^f七***唑沙宗(6,-Hydroxychlorzoxazone)。底物浓度***唑沙宗100nM,反应条件37°C,lOrain;色谱柱ZorbaxSB-C18(,-Micro);流动相A组成为CH30H/H20(10:90,v/v,%HC00H),B组成为CH30H/H20(90:10,v/v,%HC00H);梯度(min,B%):0,30%—,30%—,95%—,95%—,30%—,30%;采用TurboIonSpray离子源,在正离子检测方式下,选择MRM工作方式进行二级质谱分析。,体外抑制sf-9昆虫细胞重组表达的,猴P4502E1的活性测定如实施方案5中制备sf-9昆虫细胞重组表达的食蟹猴P4502E1的微粒体;将微粒体与固定浓度的***唑沙宗以及系列稀释的待测化合物的混合物置于反应管中,同时加入相应量的NADPH-细胞色素P450氧化还原酶,水浴。加40pL10mMNADPH溶液启动反应。,混匀后置于冰水;上述各反应管离心取上清加入到96孑L板进样板,联合运用HPLC和LC-MS测定代谢物的生成或减少,M:实验方法,定量分析和数据处理,通过化合物体外抑制实验,测得化合物体外抑制有效的抑制了^M猴P4502E1的活性。-9昆虫细胞重组共表达的,猴P4502E1和NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的代谢***唑沙宗活性测定用制备的含有食蟹猴P4502E1基因(cj72E1)和NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的杆状病毒以MOI(multiplicityofinfection)=3感染培养到指数期的sf-9细胞,并在感染后2-3日收集细胞;以磷酸盐缓冲液将收集的sf-9细胞匀浆;以差速离心法离心以制备微粒体;以磷酸盐缓冲、鶴悬微粒体沉淀,用BCA法测定蛋白含量,用一氧化碳结合法测定P450含量;将战微粒与系列稀释的***唑沙宗混合物置于反应管中,水浴。加40pL10mMNADPH溶液启动反应。,混匀后置于冰水;上述各反应管离心,取上清加入到96LI^样板,^运用HPLC和LC-MS测定代谢物的生成或减少,建立实验方法,定量分析和处理,计算得到昆虫细胞重组共表达的,猴P4502E1和NADPH-细胞色素P450氧《极原SI^谢***唑沙宗的活性,使其酶活指标Km和Vmax值处于理想范围,通过昆虫细胞重组共表达的食蟹猴P4502E1和NADPH-细胞色素P450氧化还原酶有效的代谢***唑沙宗可以产生6'-羟S4fc***唑沙宗(6,-Hydroxychlorzoxazone)。-9昆虫细胞重组共表达的食蟹猴P4502E1和NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的活性测定如实施方案7中制备sf-9昆虫细胞重组表达的,猴P4502E1的微粒体;纟,粒体与固定浓度的***唑沙宗以及系列稀释的待测化合物的混合物置于反应管中,水浴。加40nL10mMNADPH溶液启动反应。8^,混匀后置于冰水;上述各反应管离心,取上清加入到96孔板进样板,进行LCMS/MS定量分析和数据处理,通过化合物体外抑制实验,测得化合物体外抑制有效的抑制了,猴P4502C9的活性。实施例9.***唑沙宗的食蟹猴P4502E1代谢物的大量制备按技术方案所述,用制备的同时含有食蟹猴