骨和软骨的自体人成熟多能性极小胚胎样(hvsel)干细胞的细胞再生的制作方法.docx

该【骨和软骨的自体人成熟多能性极小胚胎样(hvsel)干细胞的细胞再生的制作方法 】是由【开心果】上传分享，文档一共【38】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【骨和软骨的自体人成熟多能性极小胚胎样(hvsel)干细胞的细胞再生的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。骨和软骨的自体人成熟多能性极小胚胎样(hvsel)干细胞的细胞再生的制作方法骨和软骨的自体人成熟多能性极小胚胎样(hvsel)干细胞的细胞再生的制作方法本发明提供用于修复或再生骨软骨组织的方法和组合物。所述方法和组合物提供有效量的足以再生或修复骨软骨组织的分离的可分化的人极小胚胎样干细胞(hVSELs)。所述组合物可直接用于组织给药或全身给药。【专利说明】骨和软骨的自体人成熟多能性极小胚胎样(HVSEL)干细胞的细胞再生[0001]政府资金声明本发明在政府支持下,由国家健康中心(NationalInstitutesofHealth)给予的拨款号AR056893和DK082481项下的资助完成。政府在本发明中具有某些权利。[0002]相关申请的交叉参考本申请要求2011年4月8日提交的美国申请号61/473,420的优先权,该申请通过引用全文结合到本发明中。发明领域[0003]本发明涉及包含极小胚胎样(VSEL)干细胞的组合物以及所述组合物在人体中治疗骨和软骨疾病的用途。[0004]发明背景成熟人VSELs是骨髓中常驻的小的多能干细胞群,其与组织的正常更新和再生相关。hVSELs代表性地是SSEA-4+/0ct-4+/CD133+/CXCR4+/Lin-/CD45_,其表达多能标记物(Oct-4和Nanog),并能在体内分化为所有三种胚系(germlineages)的细胞,包括成骨细胞样细胞。[0005]已表明在心肌梗塞的动物模型以及人心肌梗塞和中风患者中,在对损伤和压力的响应下其循环水平大大增加。VSELs也显示出在体内修复心脏组织中的有效性。另外,发现VSELs能拯救辐射照射后的免疫系统。这表明压力促进VSELs从BM中释放,使得这些细胞运行到损伤部位,在那里它们通过再生被损伤的组织而促进损伤组织的恢复。[0006]不同于其它成熟干细胞(MSCs,iPSCs),人VSELs(hVSELs)可由于其多能的特性而用于广泛的治疗应用中。[0007]骨骼是一种硬的结缔组织,其由嵌入矿化的基底物质的基质中的细胞和胶原纤维组成。将所述纤维用一种类似于羟磷灰石的磷酸钙形式以及与大量的碳酸盐、枸橼酸钠和镁盐浸溃;以重量计,其由75%无机物和25%有机物组成。骨修复和再生过程中的缺陷与数种人的疾病和病症的发展有关联,例如骨质疏松症和成骨不全症。骨修复机制的失败也与临床整形外科手术中的明显并发症相关,例如,骨折后纤维骨不连合、移植界面失败和大型同种异体移植失败。骨再建技术,例如用于重建因外伤、癌症手术或发育差错而出现的缺陷,也将通过促进骨修复的新方法得以改善。目前所用的重建方法,如采用自体骨移植或者附有软组织和血管的骨移植,都与成本高和难度大的显著弊端相关。例如,收集有用量的自体骨质并不容易实现,并且甚至自体移植经常也会被感染或受到再吸收问题。[0008]甲状旁腺激素(PTH)通过增加可得到的供生长板扩张和骨折愈伤组织形成的间充质干细胞(MSC)的蓄积,刺激正常骨中和骨创伤和骨折的部位处的新的成骨细胞。重要的是,PTH可刺激老化过程中成骨细胞的祖细胞以维持骨密度,而动物研究表明年长动物成骨细胞形成中诱发的增加比年幼动物更多。已表明PTH1-84和PTH1-34两者在各种动物模型和人体中,都比其它已确立的疗法对骨质具有更有效的合成代谢作用。PTH的功效起因于增加骨中MSC蓄积以刺激新的成骨细胞形成而增加骨密度的能力,因此干细胞疗法在短期内刺激新骨形成方面可比PTH更有效,同时没有高血钙症的产生。[0009]极小胚胎样(“VSEL”)干细胞分化为成骨细胞并修复骨损伤的潜能具有重大意义。已进行了研究来检测hVSELs促进重症结合性免疫缺陷(SCID)小鼠中颅面骨缺陷内骨质形成的能力。这些研究表明人VSELs(“hVSELs”)能够在体内分化为成骨细胞并再生骨组织。检测自体VSELs促进人颅面骨骼中骨重建的能力的研究已有描述,该研究检测hVSELs在人体内的功效和安全性,并为进一步开发这些多能干细胞以治疗骨缺陷和骨损失提供基础。[0010]发明概述根据一方面,本发明提供一种处理骨软骨组织的损害或损伤的方法,其包括给予该组织有效量的包含自体极小胚胎样干细胞(VSELs)的组合物,其中所述VSELs分化以修复或再生所述骨软骨组织。[0011]根据本发明,使VSELs与人体组织接触以修复或再生骨软骨组织,特别是骨和软骨。已描述了动员、收集和纯化VSELs的方法。在某些实施方案中,将如此得到的VSELs直接给予待治疗的骨软骨组织。在其它实施方案中,将VSELs掺入可具有生物可降解的基质或支架中。在某些实施方案中,选择基质以诱发VSELs对所要求的组织类型的分化。在某些实施方案中,将VSELs与促进向所要求组织的类型分化的药物或生长因子一起给药。在某些实施方案中,生长因子是一种骨形态形成蛋白质(BMP)。[0012]在某些实施方案中,所述方法涉及在组合物中提供VSELs,所述组合物用于填充或覆盖骨软骨组织中的缺陷。组合物中所用的VSELs数目可能与缺陷的体积或表面积有关。在本发明的实施方案中,所述组合物每mm3包含约20-约500,000VSELs。在另一实施方案中,所述组合物每mm3包含约40-约4,000VSELs。在本发明的一实施方案中,所述组合物每mm2包含约10-约100,000VSELs。在另一实施方案中,所述组合物每mm2包含约25-约500VSELs。[0013]在某些实施方案中,VSELs在一种包含其它有核细胞的组合物中提供。在某些这样的实施方案中,所述组合物的细胞为至少约50%VSELs。在其它实施方案中,组合物的至少约70%的细胞是VSELs。在另外的实施方案中,组合物的至少约90%或至少约95%的细胞是VSELs。[0014]VSELs可以是自体的、异体的或设计的。在本发明的一实施方案中,使用该方法治疗或修复物理损伤,包括但不限于修补骨折、修复泪软骨(cartilagetears)等。在其它实施方案中,本发明用于再生组织或生成新的组织。非限定性实例包括关节炎或一般磨损损害的软骨恢复的修复,和在原位产生新骨,例如修复脊柱或头盖缺陷。在某些实施方案中,使用该方法促进人工关节与骨骼骨的粘附。所述方法可用于治疗骨关节炎、骨质疏松症或成骨不全症。[0015]本发明还提供一种组合物,其包含有效量的足以再生或修复骨软骨组织的VSELs。在某些实施方案中,所述干细胞组合物包含每mm3约20-约500,000的VSELs,或者每mm3约40-约4,000的VSELs。在某些实施方案中,所述干细胞组合物包含每mm2约10-约100,000的VSELs,或者每mm2约15-约500的VSELs。所述干细胞组合物可包含其它有核细胞。在某些实施方案中,为VSELs的细胞的比例为至少约50%,或至少约70%,或至少约90%或者至少约95%。[0016]根据本发明,包含VSELs的组合物可进一步含有可生物降解性的基质或支架。在某些实施方案中,选择基质以促进VSELs的分化。在某些实施方案中,所述组合物包含一或多种促进分化的药物或生长因子,包括但不限于骨形态形成蛋白质(BMPs)。[0017]在一实施方案中,组合物的VSELs可分化为骨细胞。在另一实施方案中,组合物的VSELs可分化为软骨细胞。[0018]附图简述图1显示由人VSEL细胞移植进入关键尺度缺陷所引起的μCT和骨体积分数。组织的μCT分析通过SCID小鼠中的人VSELs产生。(A).移植明胶基Gelfoam海绵或人VSELs之后μCT骨质形成的代表性图像(箭头)。(B)从三名捐赠者之一的η=10的移植物中得到的定量的骨体积分数。观察到与对照细胞(人外周血CD34+单核细胞(捐赠者3))的对照组(仅含载体-阴性对照)相比,骨形成增加。对照组的显著性差异(*)Ρ〈。[0019]图2显示人VSEL细胞在颅盖缺陷中形成骨质能力的组织学考察。将小鼠颅盖缺陷用含有载体(Α,Ε)、人CD34+细胞(B,F)或人VSEL细胞(C,G-捐赠者I或D-捐赠者2)的明胶海绵(Gelfoam)载体填充。在3个月时,收集颅盖缺陷、脱钙,然后进行苏木精和曙红染色。数据表明人VSEL细胞在人源的颅盖缺陷内能生成骨组织(参见图4)。条=100微米。[0020]图3显示Masson’s三色染色呈现的hVSELs诱发颅盖缺陷的矿化作用。对来自VSELs处理的小鼠的颅盖缺陷的分析表明得到的骨组织的矿化作用。骨胶原染为蓝色,骨中未矿化或“骨样接缝”的有机基质成分染为红色。[0021]图4显示局部移植人VSEL细胞后SCID小鼠中形成的骨质内的人HLA的免疫组织化学。与泛人HLA抗体(D,E,F)或同种型相配的对照物(A,B,C)培养以及用DAPI复染确定核后,对骨/骨髓界面成像。进行骨/骨髓界面(A,D)的鉴别干涉对比(DIC)成像、检测人HLA(B,E)的免疫荧光(IF)以及DIC和免疫组织化学叠加成像。白箭头表明成骨细胞。条=5微米。[0022]图5显示VSEL产生的骨组织中的上皮细胞具有人源特性。内皮特异性标记物⑶31的人特异性抗体,其与人特异性HLA标记物共定位,证实人VSEL细胞产生的内皮细胞进入hVSEL移植物(D,E,F)中的管状结构中,但在阴性对照组(A,B,C)中未出现。进行骨(A,D)的鉴别干涉对比(DIC)成像、检测人⑶31(B,E)的免疫荧光(IF)以及DIC和免疫组织化学叠加成像。白箭头表明成骨细胞。条=5微米。[0023]图6显示免疫缺乏性小鼠中hVSEL细胞产生的矿物质含量。(A)将hVSEL细胞以2,000-500,000细胞/缺陷的剂量范围移植入颅骨缺陷中。在3个月时,对各动物组各缺陷内组织矿物质含量值进行平均。阳性对照包括表达BMP2的小鼠骨髓基质细胞,而阴性对照只由胶原载体组成。(B)为捐献者植入2,000hVSEL颅盖缺陷内形成的组织矿物质含量的均值。*P〈。[0024]图7显示对颅骨缺陷内hVSEL细胞生成的组织的组织学评估。将代表性各显微镜玻片用H&E(顶行)和Masson’s三色(底行)染色,其中胶原和骨质呈蓝色。阳性对照包括表达BMP2的小鼠骨髓基质细胞(未显示),阴性对照()仅由胶原载体独自组成。组织学结构在20X(嵌件(inserts))和40x放大率下呈现。注意到阴性对照组中留存有胶原载体基质,并且缺乏炎症细胞渗出物。在2,OOOhVSEL组中呈现含有骨髓空间的板层骨(箭头)。条=100微米。[0025]图8显示hVSEL细胞生成的组织源于人体细胞。将颅盖缺陷内hVSEL细胞形成的组织用荧光人特异性泛-人白细胞抗原(HLA)免疫染色,然后与抗细胞核着色剂(antinuclearstain)(DAPI)的图像和鉴别干涉对比(DIC)图像合并。(A)阴性对照是仅移植介质的小鼠中血管的纵切面,表明缺少人HLA着色。(B-D)用人VSEL细胞注射的小鼠中的血管的纵切面表明由细胞质人HLA着色。组织成像在40X下呈现,条=100微米。[0026]图9显示小鼠血清中存在的人骨钙蛋白。显示的是每缺陷部位未植入(阴性对照)、仅植入载体(仅有海绵)、植入表达BMP的小鼠骨髓基质细胞或者植入2,000-500,000hVSEL细胞的动物血浆(3个月)中所呈现的完整人骨钙蛋白的循环水平。将骨钙蛋白水平以标准化为所有动物/。与阴性对照相比*Ρ〈。[0027]图10显示在实验动物血中发现人体细胞。使用人特异性定量实时PCR测定所选小鼠组织(脾脏、股骨、肝右叶和全血)内存在的人体细胞。将纯小鼠骨髓用作阴性对照,将人骨髓成核细胞用作阳性对照。在2,000hVSEL细胞移植的任何动物的脾脏、股骨和肝脏中均未观察到人DNA。检测动物外周血中的人特异性与阴性对照相比*Ρ〈。[0028]图11显示hVSEL细胞生成的软骨组织源于人体细胞。将hVSEL细胞形成的组织用荧光人特异性泛-人白细胞抗原(HLA)免疫染色,然后与II型胶原(CoII)的图像和鉴别干涉对比(DIC)图像合并。[0029]发明详述本发明提供在患者中治疗或再生骨软骨组织的方法。所述方法包括得到一种自体极小胚胎样干细胞(VSELs)群,然后给予细胞以治疗或再生骨软骨组织或者生成新组织。VSELs细胞可从骨髓中得到,或者从血中动员和收集得到。给药前,一般通过富集或纯化制备VSELs,并可将其结合至支持基质中。在某些实施方案中,本发明的VSEL制备物还包括一或多种生长因子,包括但不限于骨形成因子或蛋白(BMPs)。[0030]根据本发明,VSELs的制备物可用于治疗或再生结缔组织,包括骨和软骨。软骨可以是弹性软骨、透明软骨或纤维软骨。在某些实施方案中,VSELs可用于修复关节软骨(例如骨关节炎造成的)。在另一些实施方案中,VSELs用于治疗退变性椎间盘疾病。本发明的VSEL制备物还可用于生成新骨和软骨组织,用于例如颅面修复中。[0031]本发明提供的实验结果表明人VSEL细胞能在颅盖缺陷内生成骨质结构。生成的骨质造***成骨细胞围绕的厚皮质结构,所述成骨细胞在收集时(3个月)主要具有静止或衬细胞表型。可见大量骨细胞嵌于皮质结构中,于Masons三色染色中观察到皮质组织的厚层。为验证所形成的组织源于人VSEL细胞,对带有人特异性泛人白细胞抗原抗体的组织进行染色。仅有从植入人VSEL细胞的动物中分离的组织呈现出骨髓染色,表明细胞源于人供体的细胞。也将纯化的和富集的hVSEL移植物的组织切片用对人骨钙蛋白(一种特异性成熟成骨细胞的标记物)特异性的抗体进行染色。[0032]每次移植植入200、2,000、10,000VSEL细胞能产生明显的骨填充。特别是,每次移植大量VSEL细胞不一定引起更快或更完全的再生。例如,与移植10,000或30,000VSEL细胞的缺陷相比,更多的骨组织生成于移植2,000细胞/缺陷的动物中。[0033]本文所用的术语“给予”及其各种语法形式指给或应用。本文所用的术语“给药”包括体内给药以及直接给予离体组织。一般地,可将组合物以剂量单位制剂或者经胃肠外全身给予或者经局部给药,所述剂量单位制剂包含所要求的常规无毒性药学上可接受的载体、辅助剂和介质,或者可将组合物通过以下方式定位给药,包括但不限于注射、植入、移植、局部施用或者胃肠外给药。本文所用的术语