大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代.doc

大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代
南京军区总院神经内科实验室许丽丽 2012-12-01
一、试剂
1) Poly-L-lysine(Sigma,P2636)
2) DMEM(Invitrogen,11995-065)
3) FBS(Invitroge,10099-141)
4) HBSS, no Calcium, no Magnesium(Invitrogen, 14170-112)
5) % Trypsin-EDTA (Invitrogen, 25200-056)
6) DPBS(HyClone,)
7) dd H2O
8) 75%酒精
二、器械
1) 手术器械:眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2(金钟,WA3050)、显微剪x1
2) 100 ml小烧杯
3) 200目不锈钢筛
4) 细胞计数器(求精)
5) 50ml离心管(Corning,430828)、15ml离心管(Corning,430790)
6) 25ml培养瓶(Corning,430639)或75ml培养瓶(Corning,430641)
7) 100ml玻璃瓶(蜀牛)
8) 直径为60mm的培养皿(LabServ,310109010)
9) 3ml移液管(Biologix, 30-0138A1)
1
10) 过滤器(Millex-GP, SLGP033RB)
11) 注射器:50ml、5ml各 1
12) Pipette and pipette tips
13) 冰袋、手套、口罩
2
Day 1
1、消毒
将解剖器械、枪头高温高压消毒15分钟,消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。
打开操作台紫外线灯消毒30分钟。
2、包被培养板
戴手套,用酒精棉球擦拭操作台、移液枪,点燃酒精灯。
取PLL,用DPBS将其稀释至100μg/ml。
以PLL包被培养瓶,量以覆盖培养瓶底面为宜。25ml培养瓶:3ml;75ml培养瓶:8ml。过夜。
3、配置培养基、消化酶
DMEM with 10% FBS
FBS:DMEM=1:10
取FBS 8ml、DMEM 80ml加入100ml高温高压过的玻璃瓶中。
%胰酶
%Trypsin-EDTA,用DPBS稀释2倍。
将配置好的培养基、消化酶放入4°C冰箱中,待第二天使用。
4、消毒
操作台使用完毕后清理垃圾,用酒精棉球擦拭操作台、移液枪,关闭酒精灯,打开紫外线灯消毒30分钟。
Day 2
3
1、消毒
打开操作台紫外线灯消毒30分钟。
2、洗板
用ddH2O洗涤3 x 5 min,放入培养箱中晾干。
3、解剖新生鼠(所有操作在冰袋上进行)
将出生24小时之内的新生鼠在100ml烧杯中用75%酒精浸泡5min。
,用酒精棉球擦拭操作台、移液枪,点燃酒精灯。
取2个培养皿,内乘HBSS,放置在冰袋上。
剪去新生鼠的头,将头放入一个培养皿中。
用眼科剪把新生鼠头骨剪开,取出脑组