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免疫组化基本理论
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*. 完全抗原(Complete antigen): 大多数蛋白质和部分大分子多糖等, 分子量(MW)大.
*. 半抗原(Hapten): 大部分多糖, 类脂和多肽等, M杂交瘤细胞只产生一种抗体, 对一个抗原决定簇发生反应, 即单克隆抗体.
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C. 抗原-抗体反应: 抗原和抗体发生特异性结合, 解离系数10-11M. 抗原-抗体反应的高度特异性, 高亲合力及形成不溶性复合物等特性是免疫组化的基础.
II. 常用标记物及其检测: 荧光染料, 酶, 生物素和胶体金等用于标记抗体, 抗原, 蛋白A和凝集素等.
A. 荧光染料:
1. 简介: 即荧光色素, 能吸收特定波长的高能量光波而受到激发(Excitation), 进而以特定波长(荧光)将能量发散(Emission).
a. 异硫***酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate, FITC): 490~5→520~30nm, 黄绿色.
b. 四***异硫***酸罗达明(Tetramethyl rhodamine isothiocyanate, TRITC): 550→620nm, 橙红色.
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FITC-conjugated 2nd antibodies show tubulins, PI shows nucleus in Hela cells
TRITC-conjugated 2nd antibodies show vimentins, FITC-conjugated phalloidin shows actins, DAPI shows nuclei in cultured AGMKC (African Green Monkey Kidney Cells, Vero cell line)
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c. 羰花青(Carbocyanine)系列:
*. Cy2: 489→506nm. 绿色.
*. Cy3: 550→570nm. 红色.
*. Cy5: 650→670nm. 暗红色.
The Cy3-conjugated 2nd antibodies show microtubular network, and DAPI shows nucleus in PtK2 cells.
d. Alexa Fluor系列:
*. 488: 495→519nm, 绿色.
*. 568: 578→603nm, 红色.
Alexa Flour 568- conjugated 2nd antibodies show tubulins, Alexa Fluor 488 conjugated-phalloidin shows actins, DAPI shows nucleus.
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e. Dylight系列: 对pH改变不敏感, 容易激发荧光强烈且淬灭时间长.
*. DyLight 350 353→432nm.
*. DyLight 488 493→518nm.
*. DyLight 549 562→576nm.
*. DyLight 594 593→618nm.
*. DyLight 633 638→658nm.
*. DyLight 649 654→673nm.
Dylight 488-2nd anti-GFAP, DAPI shows nuclei. Nerve tissue.
Texas Red, DyLight594和Alexa594的发散荧光比较
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f. 德克萨斯红(Texas red): 595→620nm, 红色荧光. 除抗体外还可标记鬼笔环肽等.
g. ***硼二吡咯(Bodipy)系列: 除抗体外还可标记鬼笔环肽, 蛋白, 核苷酸和糖脂等.
*. BODIPY TR: 589→617nm, 红色.
*. BODIPY FL: 503→512nm, 绿色.
BODIPY FL-conjugated 2nd antibodies show alpha-tubulins, Texas red conjugated-phalloidin shows actins, DAPI shows nucleus in cultured bovine pulmonary artery endothelial cells
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2. 荧光抗体的制备：
a. 原理: 在碱性环境下, FITC或TRITC的异硫***酸基(Isothiocyanic acid group)与抗体的