第七章重组和鉴定.ppt

第七章重组和鉴定
第七章基因的重组与转移过程
第七章重组和鉴定
切
接
转
增
检
第七章重组和鉴定
一、 DNA的体外重组(切与接)
同种内切酶产生的粘性末端的连接
同尾酶生产的粘性末端的连接
不同粘性末端的连接
人工粘性末端的连接
粘性末端的更换
重组率
第七章重组和鉴定
(1) 同种内切酶生产的粘性末端的连接
5'
5'
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
EcoRI
5'
G
CTTAA
AATTC
G
5'
5'
G
CTTAA 5'
5'
AATTC
G
5'
退火
G
CTTAA
AATTC
G
5'
G
CTTAA
5'
AATTC
G
T4-DNA ligase
GAATTC
CTTAAG
5'
5'
GAATTC
CTTAAG
第七章重组和鉴定
(2) 同尾酶生产的粘性末端的连接
BamHI
5'
5'
CCTAGG
CCTAGG
G
CCTAG
G
T
ACTAG 5'
5'
GATCA
T
5'
5'
TGATCA
ACTAGT
5'
BclI
G
CCTAG
5'
T
ACTAG
GATCA
退火
T4-DNA ligase
ACTAGG
5'
5'
GGATCA
CCTAGT
第七章重组和鉴定
(3) 不同种酶产生的粘性末端的连接
用两种限制性内切酶分别消化载体和外源DN***段,,在连接酶的作用下相同的粘性末端可退火形成重组DNA分子,实现DNA定向连接.
第七章重组和鉴定
(4) 不同粘性末端的连接
BamHI
5'
5'
CCTAGG
CCTAGG
G
CCTAG
G
5'
5'
CTGCA
G
5'
G
ACGTC
3'
T4-DNA ligase
GCTAGG
5'
GGATCG
CCTAGC
5'
CTGCAG
GACGTC
5'
PstI
3'
T4-DNA pol
切平
5'
C
G
5'
G
C
Klenow
补平
5'
GGATC
CCTAG
5'
CTAGG
5'
5'
第七章重组和鉴定
(5) 人工粘性末端的连接 5‘突出末端
5'
G
CCTAG
G
5'
5'
G
CTTAA 5'
5'
5' AATTC
G
5'
5'
Klenow
补平
Klenow
补平
GGATC
CCTAG
CTAGG
5'
GAATT
CTTAA 5'
5'
5' AATTC
TTAAG
TdT
TdT
dGTP
dCTP
GAATTGGGGGG
CTTAA
AATTC
GGGGGGTTAAG
CCTAG
TAGG
TAGG
AATTC
CCTAGGGGGGGTTAAG
退火
BamH I
BamH I
EcoR I
BamH I
第七章重组和鉴定
(6) 人工粘性末端的连接 3‘突出末端
CTGCA 3'
G
G
3' ACGTC
5'
GCATG 3
C
5'
C
3 GTACG
T4-DNA ligase
TdT
TdT
dCTP
dGTP
3
C
退火
Pst I
Pst I
C
GTACG
CTGCAGGGGGG 3'
G
G
3' GGGGGGACGTC
5'
5'
G
C GGGGGGACGTC
CTGCAGGGGGG C
GTACG
5'
5'
TGCAG
CGTACGGGGGGACGTC
CTGCAGGGGGGCATGC
GTACG
Klenow
Pst I
Sph I
第七章重组和鉴定