酶的分离与纯化注意事项.ppt

酶的分离与纯化注意事项及酶分离纯化为什么进行酶活力和酶比活力测定 PPT 制作:陈玉成,金昱资料查找:郭姗姗 PPT 讲解:田恩平 1 酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎酶提取酶分离纯化酶浓缩酶贮存动物、植物或微生物细胞发酵液离心分离,过滤分离,沉淀分离,层析分离,电泳分离,萃取分离,结晶分离等。 2 2 酶的纯化过程, 约可分为三个阶段: (1) 粗蛋白质(crude protein): 采样→均质打破细胞→抽出全蛋白, 多使用盐析沉淀法;可以粗略去除蛋白质以外的物质。(2) 部分纯化(partially purified): 初步的纯化, 使用各钟柱层析法。(3) 均质酶(homogeneous): 目标酶的进一步精制纯化,可用制备式电泳或HPLC 。酶分离纯化不同阶段本章目录 3 3 ??酶的提取是指在一定的条件下,用适当的溶剂或溶液处理含酶酶的提取是指在一定的条件下,用适当的溶剂或溶液处理含酶原料,使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。原料,使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。??酶提取时首先应根据酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质,选择适当的溶剂酶的结构和溶解性质,选择适当的溶剂。。一般说来,极性物质易溶于极性溶剂中,非极性物质易溶于非一般说来,极性物质易溶于极性溶剂中,非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中,酸性物质易溶于碱性溶剂中,碱性物质易极性的有机溶剂中,酸性物质易溶于碱性溶剂中,碱性物质易溶于酸性溶剂中。溶于酸性溶剂中。??酶都能溶解于水,通常可用酶都能溶解于水,通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取提取,有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团,则可用有,有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团,则可用有机溶剂提取。机溶剂提取。酶的提取: 提高温度,降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离,增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度,从而增大提取效果。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活,在提取过程中还要注意控制好温度、 pH值等提取条件。 4 酶提取过程中应注意事项: ?根据酶提取时,所采用的溶剂或溶液的不同,酶抽提的方法主要有盐溶液提取,酸溶液提取,碱溶液提取,有机溶剂提取等。?盐溶液提取: ?大多数酶在一定浓度的盐存在条件下,酶的溶解度增加,即盐溶,但盐浓度不能太高,否则溶解度反而降低, 即盐析。故:一般采用稀盐溶液进行酶的提取,盐浓度控制在 — 。?例如:用固体发酵生产的麸曲中的α--淀粉酶,糖化酶、蛋白酶等胞外酶,用 /L的***化钠溶液或 ~ /L的磷酸缓冲液提取;酵母醇脱氢酶用 ~ /L的磷酸氢二钠溶液提取;有少数酶,如霉菌产生的 5 在酶的提取过程中,为了提高提取率并防止酶变性在酶的提取过程中,为了提高提取率并防止酶变性失活,须注意以下几点: 失活,须注意以下几点: ??1 : .温度: ??通常抽提温度应控制在通常抽提温度应控制在 0-10oC 0-10oC ( ( 0-4 oC 0-4 oC )。对某些耐温的酶,如胃蛋)。对某些耐温的酶,如胃蛋白酶等,可适当提高抽提温度,在白酶等,可适当提高抽提温度,在 37 oC 37 oC 下保温抽提,效果较好