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免疫组化基本理论
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*. 完全抗原(Complete antigen): 大多数蛋白质和部分大分子多糖等, 分子量(MW)大.
*. 半抗原(Hapten): 大部分多糖, 类脂和多肽等, MW小. 仅具免疫反应性.
*. 半抗原抗体的生成: 用戊二醛等将钥孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin, KLH), 牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA), 卵白蛋白(Ovalbumin, OVA)或甲状腺球蛋白(Thyroglobulin )等大分子(载体, Carrier)和MW小的半抗原结合后免疫动物. 但机体可产生载体抗体.
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2. 特性:
a. 异物性:
*. 异种或同种异体物质: 种属关系越远免疫原性越大, 交叉反应越弱. 反之亦然.
*. 自身组织: 特殊情况下释放隐蔽的抗原引起自身免疫.
b. 理化特性: 分子量>10kDa, MW越大, 结构越复杂免疫原性越强.
c. 特异性: 抗原具有只与相应抗体发生结合反应的特性, 其物质基础是抗原分子表面少于8个氨基酸, 糖或核苷酸残基构成的表位(Epitope)或称抗原决定簇(Antigenic determinant).
*. 抗原一级和空间结构影响抗原决定簇.
*. 抗原决定簇越多, 间距越大, 免疫原性越大.
*. 酶解或变性可暴露蛋白内部的抗原决定簇.
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在氨基端(N端), 重链的1/4和轻链的1/2组成可变区(Variable region, V区), 其氨基酸排列顺序变化很大, 用于结合不同的抗原决定簇. 在羧基端(C端), 重链的3/4和轻链的1/2组成稳定区(Constant region, C区), 其氨基酸排列顺序比较恒定.
B. 抗体: 免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig).
1. 分子结构: 一对重链(Heavy chain)和一对轻链(Light chain)通过二硫键连接成对称性的“Y”形.
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2. 功能结构:
a. 抗原结合片段(Antigen binding fragment, Fab): “Y”顶部. 每个Fab由一条完整的轻链和一条不完整的重链组成. 因一个抗体有两个Fab, 因此可结合2个抗原.
b. 可结晶片段(Crystallizable fragment, Fc): “Y”, 可与补体等结合, 是调节抗体生物活性的部分.
c. 绞链区(Hinge region): 连接Fab和Fc的狭窄区, 易弯曲扭转或被木瓜酶和胃蛋白酶解.
*. 调理作用(Opsonization): 免疫细胞对IgG结合的抗原反应迅速且激烈, 因为这些细胞本身有IgG的Fc受体.
3. 抗原性: 抗体分子量约150kDa, 具有抗原性.
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4. 分类:
a. IgG: 最多. 是能穿过胎盘屏障的唯一类型.
b. IgA: 分泌物中的主要类型. 蛋白J结合2~3个IgA单体, 并与分泌蛋白结合后形成分泌性IgA(SIgA).
c. IgM: 免疫反应中首先出现的类型. B细胞CM上单体IgM与抗原的结合, 对B细胞转变成浆细胞非常重要. 血循环中五聚体IgM与抗原结合后, 能激活补体系统, 该系统包括肝脏合成的C3等20余种蛋白, 能增强免疫反应.
d. IgD: B细胞CM, 功能不明.
e. IgE: 其Fc段与肥大细胞CM的Fc受体结合, 引起脱颗粒造成过敏反应(Allergy).
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小肠上皮吸收细胞与M细胞合作, 形成分泌性IgA (SIgA).
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IgE的Fc段与肥大细胞CM结合, 引起脱颗粒, 造成过敏反应.
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5. 生成:
a. 多克隆抗体(Polyclonal antibody):
*. 抗原分子上有许多不同的抗原决定簇, 免疫动物体时 每个抗原决定簇激活一种合成抗体的细胞克隆, 产生许多种lgG (针对同一抗原的多种抗体混合物), 即多克隆抗体.
*. 多克隆抗体易与类似抗原(即含类似抗原决定簇)发生交叉反应.
*. 多克隆抗体分离自动物血清, 也称抗血清.
b. 单克隆抗体(Monoclonal antibody):
*. 用特异性抗原免疫小鼠, 分离抗体产生细胞.
*. 与不产生抗体但能不断增殖的细胞系骨髓瘤细胞融合, 形成杂交瘤(Hybridoma).
*. 将杂交瘤细胞克隆化, 每个杂交瘤细胞只产生一种抗体, 对一个抗原决定簇发生反应, 即单克隆抗体.
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C. 抗原-抗体反应: 抗原和抗体发生特异性结合, 解离系数10-11M. 抗原-抗体反应的高度特异性, 高亲合力及形成不溶性复合物等特性是