荧光信号放大检测技术在生物大分子检测中的研究和应用.pdf

荧光信号放大检测技术在生物大分子检测中的研究和应用湖南大学博士学位论文他堂丝王堂院学校代号:学级:学位申请人姓名:郭趑垩导师姓名及职称:王扭筮教援培养单位:专业名称:盆抚丝堂论文提交日期:生旦论文答辩日期:生月日答辩委员会主席:盒遗勤院±号:密;鐊.,‘’』;/,.‘
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秆事呵≯Ⅻ引堋舢引堋训啤协月学位论文原创性声明学位论文版权使用授权书湖南大学⒉槐C堋本人郑重声明:所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名:本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于年解密后适用本授权书。朐谝陨舷嘤Ψ娇蚰诖颉啊獭⒈C芸冢作者签名导师签名日/
摘要号转换手段和建立新的生物分子信号放大检测技术平台来解决生命研究过程中的多年来,人们一直致力于发展和完善生物大分子的研究和分析方法,使其更加灵敏、精确、便捷、经济,以满足各个领域对其越来越高的要求。生物分子信号放大检测技术是近年来发展起来的一种利用各种工具酶和纳米颗粒等手段,并结合电化学、光学、压电等技术的高灵敏检测方法,可实现对生物分子的直接高灵敏检测,是生物分析科学领域中的一个研究重点和热点。如何利用现有分子生物学技术和手段将生物分子的含量、相互作用等信息实时、灵敏、特异地转化为易于检测的物理量并拓展其在分子生物学及生物医学中的应用,如何设计新的信新问题,仍然是生物医学和分析化学工作者所面临的重大科学问题。本论文以上述科学问题为目标,以核酸和蛋白质这两类组成生命的最主要生物大分子为研究对象,利用多种核酸工具酶和荧光核酸探针技术,建立了一系列简便、快速的生物大分子荧光信号放大检测技术平台,在核酸定量分析、点突变觳狻⒍嘀氐ズ塑账岫嗵蚍中秃偷鞍字实牡姆治龇矫娴玫街匾Sτ谩V饕D谌莨槟扇缦拢⒒诮咏有вΦ墓龌防┰琑椒ǖ建立及用于点突变的高灵敏检测。滚环扩增技术由于具有高灵敏、高特异性和等温操作等诸多优点,在生物化学分析和临床医学诊断中有很好的应用前景,,限制了滚环扩增技术的广泛应用。本部分在普通的滚环扩增技术基础上,利用接近连接效应原理,。该方法不但解决了普通滚环检测技术中存在的长片段铣赡押统杀靖叩奈侍猓姨岣吡讼咝云纬苫返男剩为滚环扩增的进一步广泛应用提供了帮助,并利用该方法合成的挂锁探针进行滚环扩增实现了对基因点突变的高灵敏检测。⒒诜肿有疟甑牡任卵妨粗没痪酆厦阜从Φ挠ü庑藕欧糯蠹际跤糜诤怂的检测。利用特殊设计的长臂分子信标作为聚合酶反应的模板和检测探针,在靶核酸分子与分子信标杂交中引发引物与分子信标臂部退火,在酆厦复嬖下产生循环的链置换聚合酶反应,从而实现了对靶核酸的荧光信号循环放大检测。该技术以靶辗⒘粗没痪酆厦阜从Φ难贩⑸词迪中藕欧糯螅扌柚接扩增靶肿樱苊饬朔从Σ镂廴荆⑶疑杓萍虻ァ⒉僮骷虮憧旖荩⒃等温条件下反应,灵敏度高,检测下限可达/:怂岫糠治龊筒《检测提供了一种简单、快速、高灵敏的荧光信号放大分析方法,有望在病毒检测荧光信号放大检测技术在生物大分子检测中的研究与应用
分析等方面得到广泛的应用。⒒谇锌堂附榈嫉难妨粗没痪酆戏从τ糜诙嘀豐挠ü庑藕欧糯蠹测。癌症、心脑血管疾病和精神性疾病等复杂疾病均由多个相互作用引起,因而在关联分析研究中同时对多个进行基因分型和检测已成为多基因复杂性状疾病的遗传易感性研究的重要技术手段。目前基于杂交稳定性的差异或点突变引起的酶反应速度差异的多重基因分型和检测方法具有分析点突变差异不显著的缺点,并同时很难将多个等位基因完全有效地分开,且没有信号放大检测的过程。本部分设计合成了分别带信号识别序列、酶切位点和引物识别序列的等位基因核酸探针,通过连接酶反应,巧妙结合切刻内切酶和聚合酶反应,建立了一种等温、快速、高灵敏和高特异的等温循环荧光信号放大的多重检测技术平台。该方法同时将多重基因的点突变信号准确转换为了多种具有显著差异、并可循环生成的单链藕攀侗鹦蛄蟹肿樱⒂氪煌ü獗记的分子信标识别,获得不同的荧光信号,从而准确实现了对多重的信号放大检测。该检测平台克服了现有检测方法的缺陷,操作简单,等温反应,既能准确判断,又能将检测信号进行放大,还能对多个等位基因同时进行分析,为相关疾病筛查和临床诊断、防治和手术预后监测提