免疫原和抗血清的制备.ppt

免疫原和抗血清的制备
免疫原和抗血清的制备
第一节免疫原的制备
免疫原是能够引起机体产生抗体，并能与之发生反应的物质
一、颗粒性抗原的制备：
。　　　  ：
H抗原　有动力的菌株　O抗原 100℃　2-　为了 破坏H抗原，获得O抗原Vi抗原
、细胞膜颗粒抗原呈乳浊状，多用V内免疫，较少用佐剂作皮内注射
免疫原和抗血清的制备
二、可溶性抗原的制备：
组织和细胞粗抗原的制备：
：　组织匀浆制备：　标本要求：新鲜或低温（＜-40℃）保存的去除表面包膜或结缔组织或一些大血管，脏器应进行  灌注，除去血管内残留血液  　　　　　　
制备　处理好组织→％NaN3生理盐水洗净→剪成小块　粉碎→高速组织捣碎机法→2000-3000rpm离心10min     研磨法：玻璃匀浆器,乳钵研磨     →上清　10000-20000rpm 20-30min高速离心
免疫原和抗血清的制备
：
细胞抗原　细胞膜蛋白抗原　　　　　细胞浆抗原　　　　　细胞核及核膜抗原粉碎：　　（1）反复冻融法　　（2）冷热交替法：适合细菌，病毒蛋白质及核酸　　（3）超声破碎法：适合于微生物和组织细胞 细菌，尤其真菌厚膜孢子难破坏　　（4）自溶法：利用组织和微生物的自身酶系　　　　需一定PH和温度动物组织cell　0-4℃　　　　　　　　微生物　　　　室温　　（5）溶菌酶法：一定PH（），溶菌酶可专一破坏菌胞。蜗牛酶，纤维素酶消化细菌和组织cell　　（6）表面活性剂处理法
免疫原和抗血清的制备
蛋白质抗原的制备和纯化：
可溶性抗原绝大部分为蛋白质
： 用来分离亚细胞部分及大分子蛋白质1）差速离心：高低速交替进行。将大分子物质分离2）梯度密度离心：区带分离法，通过梯度密度来维持重力的稳定性，通常分离的悬液中的颗粒比液体重，要使之上浮，必须加入第三种成份，其密度连续或不连续升高，即所谓梯度3）第三种成份多用甘油、蔗糖***化色，***化铷适合于少部分大分子抗原，对于大量的中、小分子量的蛋白质抗原不适用此法
免疫原和抗血清的制备
：
用沉淀剂或改变某些条件促使抗原成分沉淀1）核酸除去法：　　　　　　　（1）提取沉淀剂：　　　　　　　（2）核糖核酸酶降解法：用DNA或RNA酶与提取液作用30-60min（4℃），即可除去核酸2）盐析沉淀法：　　　　　　　（1）抗原的粗筛　　33-50％饱和度的硫酸铵　　　　　　　（2）提取丙种球蛋白　　主要为IgG　33-40％饱和度的硫酸铵　　　　　　　（3）抗原的浓缩3）有机溶剂沉淀法：　　　　　　　 有机溶剂多为酒精和***4）水溶性非离子型聚合物沉淀法：　　　　　　　PEG+蛋白质颗粒→沉淀、复合物、蛋白质发生水的重分配分子量2000-6000PEG可用于沉淀蛋白PEG浓度不同可沉淀不同pro3-4％沉淀免疫复合物6-7％沉淀IgM　8-12％沉淀IgG　12-15%沉淀其他球蛋白　　　　　　　25％沉淀白蛋白
免疫原和抗血清的制备
：
1）分析筛层析又名凝胶过滤，将Ag分成大、中、小三种　　　　　　大分子较快出来，小分子因被阻留，出来较慢。根据分子量不同 2）离子交换层析：离用带离子基因的纤维素　　　　　　流动相逐步增加离子强度，蛋白质按电荷不同或量的差异分组常用DEAE纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）　　　　　　根据pro携带电荷不同（溶液中等电点不同）　　　　　　常用于分离IgM　　　　　　因为IgM分子量大　　　　　　凝胶过滤洗脱曲线
免疫原和抗血清的制备
：
利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间的具有的专一性亲和力而设计的层析技术。　　　　　　eg：Ag和Ab，酶和酶的抑制剂，酶蛋白和辅酶，激素和激素受体等其之间有特殊亲和力，可紧密结合成复合物.1）亲和层析支持物的选择：　　　常用：琼脂糖珠（Sepharose 2B、4B、6B）
免疫原和抗血清的制备
2）配体的选择：　3）抗原或抗体与支持物的结合：　　　步骤：　（1）活化支持物上的功能基因　　　溴化氛PH11　与支持物上的羟基形成氨基形成氨基甲酸酯基因　（2）交联（联接）　（3）清洗：除去未结合的pro　（4）亲和层析条件的选择：
原理：一定条件下，Ag和Ab能可逆性地结合成复合物，当条件改变（如稀酸、稀碱