农药毒理学实验指导.doc

昆虫乙酰胆碱酯酶活性的测定
一、实验目的:
了解乙酰胆碱酯酶的作用,掌握乙酰胆碱酯酶活性的测定方法。
二、实验材料
试剂:, (PBS) ; ATCh液; 100m1即成。DTNB液:称取DTNB13mg加pH7. 2PB S 1 OOml即成。本试验选用残杀威杀虫剂作为抑制剂,在测试前按不同比例用乙醇充分溶解。
三、实验步骤
样品制备:采用本所饲养的淡***蚊Culex pipiens pallens Coquillett敏感品系蚊虫和室内选育的抗残杀威品系淡***蚊作酶源。将N龄幼虫或刚羽化3-4天未吸血雌性成蚊,放人1. 5m1离心管中,加100[1 ,10000r/min离心15min,取上清液再加900pl ,待用。
实验方法:将100协1蚊虫混匀液,滴人%孔微滴定板孔中,每孔再加混有1 x 10-4mol/L的残杀威ATCh液1 OOmhZ,,放30 C孵育30分钟后,每孔再加100ul DTNB液,待反应5分钟后,用酶标仪(北京新技术研究所提供MB- III型)进行比色。
四、结果分析
在410mu波长下读取光密度。每只蚊虫可测4-10孔取其OD平均值。
昆虫中肠淀粉酶活性测定
一、实验目的:
了解中肠淀粉酶的作用,掌握中肠淀粉酶活性的测定方法。
二、实验方法
肠液的提取:
电刺激法取肠液,10K离心5min,上清液为酶液,用0 85%生理盐水稀释5倍备用。
2:测定步骤:
α淀粉酶及(α+β) 淀粉酶的活性测定每个重复区用5个试管,同时做等量对照试管,每个试管加酶液1mL,在70℃恒温水浴中加热15min,取出后迅速用自来水冷却。,对照管加4mL0 4mol/LNaOH,纯化酶的活性。将对照与测试管置于40℃(±0 5℃)恒温水浴中保温15min,各管加入40℃左右预热的淀粉液2mL,摇匀,立即放入40℃水浴中保温5min,取出后迅速加入4mL0 4mol/LNaOH,终止酶反应。
三、结果分析
在410mu波长下读取光密度。取其OD平均值。
昆虫中肠酯酶活性的测定
一、实验目的:
了解中肠酯酶的作用,掌握中肠酯酶活性的测定方法。
二、实验材料
供试物质与供试昆虫β谷甾醇,含量95%;瑞香亭,含量95%;狼毒色原***,含量95%。
三、实验方法
处理昆虫时,用β-谷甾醇等3种化合物(200μg mL)和印楝素(80μg mL)处理叶碟后连续饲喂菜粉蝶5龄幼虫,72h后取样。每处理取中肠10条,放入玻璃匀浆器中,加1mL磷酸盐缓冲液(0 04μmol mL,pH=7),在冰浴中匀浆,将匀浆液倒入离心管中离心(2100G,15min)后取上清液用缓冲液稀释10倍作为酶液。用“Folin-酚”法测定酶液母液中蛋白质含量,即1mL酶液母液+5mLFolin-甲液+0 5mLFolin-乙液+1mL双蒸水,然后在30℃下反应30min后,求出OD500值,从标准曲线上求出1mL酶液中蛋白质的量(mg),最后换算成mg蛋白质/min水解α-醋