2021年2021年度基因打靶技术讲义.ppt

(一)基因打靶的原理
基因打靶(gene targeting)是根据DNA同源重组的原理而设计的一项技术。在这一技术中，体内细胞基因组的某一段DNA序列被视为“靶子”，经精巧构建的欲导入的外源基因DNA序列被视为“弹头”，这样导入的外源基因进入受体细胞后就不再是随机整合而是“弹头”锚准“靶子”进行准确的定点整合。
基因打靶技术
2021/1/25
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打靶载体(targeting vector)。
如何使外源基因能定点整合于靶基因上呢?根据DNA同源重组的原理，导入的外源基因必须和靶基因有一定的同源序列。因此，外源基因导入前必须经过精巧的构建，经构建的外源基因称为打靶载体(targeting vector)。
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打靶载体
野生ES细胞
突变ES细胞
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基因打靶的结局有如下可能：
(1)基因击入(gene knock-in)
在受体细胞基因组中定点引入一个完全新的基因。
(2)基因敲除(gene knock-out)
受体细胞内源靶基因被灭活,。
(3)基因替代(gene replacement)
靶基因被导入的外源基因替代，可以是以正常基因替代突变的内源基因。
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(二)基因打靶的方法：
进行基因打靶要经历以下步骤：
（1）构建打靶载体。
（2）打靶载体导入受体细胞(常用胚胎干细胞(embryonic stem cell，即ES细胞)。
（3）打靶ES细胞导入囊胚。
（4）囊胚植入假孕母鼠子宫发育。
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1. 打靶载体的构建：
基因打靶的关键在于构建打靶载体。在打靶载体中需要一个与靶基因同源的DN***段，这一片段称为同源重组指导序(homologous recombination directing sequences, HRDS)。外源基因插入这一同源序列之中。长度可从3kb至15kb。
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通过同源重组将外源基因导入固定位点,从而有目的的突变内源基因，图中单线表示内含子，框图表示外显子
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打靶载体
野生ES细胞
突变ES细胞
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2. 外源基因导入靶细胞：
基因打靶所使用的受体细胞一般用胚胎干细胞(ES细胞)，ES细胞是一种多潜能的干细胞，能在体外传代而不改变其多潜能性。小鼠胚胎干细胞是从着床前胚胎(孕3 － 5天)内细胞群分离的细胞。
1981年由英国剑桥大学的Evans和Kaufman首先分离培养成功。
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英国卡迪夫大学(Cardiff University)卡迪夫生命科学学院Martin J. Evans
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外源基因导入ES细胞的方法有:




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外源基因导入ES细胞与否，还需经过G418和GANC培养基筛选。由于同源重组的频率很低，因而筛选并富集真正发生了同源重组的细胞是至关重要的。筛选可采用正负选择法。实现基因打靶的ES细胞能抵抗G418 而不能利用GANC。
G418 GANC
导入外源基因的阳性ES细胞的筛选
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