扫描电镜样品的准备
A 悬浮培养的细胞、细菌、血细胞、精子等;
细胞使用PBS或无血清培养基离心漂洗1~2次以去除血清,离心转速依据不同离心机、不同样品自定,总时间控制在5min内;%戊二醛吹悬,滴加在预先置入青霉素小瓶中的托盘,4℃静置沉降2~3天,在托盘周围加入PBS,以防止样品干燥。
B贴壁培养的细胞:
在培养皿中预先加入盖玻片,使细胞贴附于盖玻片上;PBS或无需请培养基漂洗后,放置在培养板室温固定1h,4℃ 3 h,注意放置干燥,自行转入青霉素小瓶中,加满PBS送检。
SEM标本处理必须使用玻璃容器,需明确所用盖玻片尺寸可以放入青霉素瓶。
C组织取材
样品观察表面可达8~10mm2,高度小于5mm左右;
样品表面在固定前必须清洁:使用生理盐水或PBS冲洗掉表面的灰尘以及不需要观察的蛋白、粘液等。能够明确标识标本的观察面。消化道、呼吸道、血管、***官、泌尿等官腔内表面,尤其要注意先清洗再固定。
如需要观察脏器内结构,应依照不同的实验目的,决定目的脏器是否需要灌注清洗;
%戊二醛浸没标本,室温1h,4℃固定3h以上,换PBS送检。
附:%戊二醛的配制
Step 1:
:
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磷酸二氢钠()
磷酸氢二钠 () 29克
双蒸馏水 加至500毫升
Step 2:
戊二醛固定液的配制:
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25% 戊二醛 1ml
双蒸馏水 4ml
5ml
戊二醛最终浓度 %
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透射电镜样品的制备
一、培养细胞
本方法适用于贴壁、悬浮培养的细胞;细菌;精子;血细胞等。
细胞数量:106或6孔板一孔的细胞达到生长面积的80%或以上。
离心收集:消化或用细胞刮刮下细胞。如细胞状态一般或漂浮物较多,建议更换新培养基;如观察自噬,建议刮下细胞。
离心速度、时间依据不同离心机、不同样本自行定义,时间在5min内;
细胞团大小:~,或者参照1元硬币的厚度;
细胞离心成团后去除上清,%电镜用戊二醛500μl固定,切勿吹悬,室温1h,4℃ 3 h后,去除戊二醛加满PBS后4℃放置或送检。
注意:固定细胞不需要吹悬,细胞不宜过多,过多会导致固定液无法迅速渗透到底部细胞;
二、生物组织
迅速剪下/切下相应位置,%戊二醛中,依据
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