2021年实验室血清学常用检验方法.doc

常见血清学检测方法介绍
一、酶联免疫吸附试验诊疗技术
现在，该项技术已在兽医学上得到广泛应用，大多数动物传染病全部已经研制成ELISA检测方法。
1、酶联免疫吸附试验原理
ELISA基础是抗原或抗体固相化及抗原或抗体酶标识。结合在固相载体表面抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标识抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶活性。在测定时，受检标本（测定其中抗体或抗原）和固相载体表面抗原或抗体起反应。用洗涤方法使固相载体上形成抗原抗体复合物和液体中其它物质分开。再加入酶标识抗原或抗体，也经过反应而结合在固相载体上。此时固相上酶量和标本中受检物质量呈一定百分比。加入酶反应底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物量和标本中受检物质量直接相关，故可依据呈色深浅进行定性或定量分析。因为酶催化效率很高，间接地放大了免疫反应结果，使测定方法达成很高敏感度。
2、ELISA类型
依据试剂起源和标本情况和检测具体条件，可设计出多种不一样类型检测方法。用于动物疫病检测ELISA关键有以下多个类型：
①.双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法是检测抗原最常见方法。在临床检验中，此法适适用于检验多种蛋白质、微生物病原体第二价或二价以上大分子抗原，但不适适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。比如猪瘟病毒检测ELISA、禽流感病毒抗原捕捉ELISA，就是依据这种原理设计。
②.双抗原夹心法测抗体
反应模式和双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测对应抗体。和间接法测抗体不一样之处为以酶标抗原替换酶标抗抗体。乙肝HBs检测常采取本法。本法关键在于酶标抗原制备，需要依据抗原结构不一样，寻求适宜标识方法。
此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，所以其敏感度相对高于于间接法。另外，该方法不受被检动物种属差异限制。
③.间接法测抗体
间接法是检测抗体常见方法。其原理为利用酶标识抗体（抗免疫球蛋白抗体），检测和固相抗原结合受检抗体（见图1）。操作步骤以下：
（1）将特异性抗原和固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合抗原及杂质。
（2）加稀释受检血清，保温反应。血清中特异抗体和固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中其它成份在洗涤过程中被洗去。
（3）加酶标抗抗体 可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但通常多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。固相免疫复合物中抗体和酶标抗体抗体结合，从而间接地标识上酶。洗涤后，固相载体上酶量和标本中受检抗体量正相关。
（4）加底物显色
本法关键用于对病原体抗体检测而进行传染病诊疗。间接法优点是变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测对应抗体方法。

间接法在动物疫病抗体检测中应用广泛，比如禽流感间接ELISA，用禽流感病毒NP蛋白包被成抗原板，待检血清中抗体和之结合，再加酶标二抗反应，能够检测全部A型禽流感病毒抗体。
④.竞争法测抗体
当抗原材料中干扰物质不易除去，或不易得到足够纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中抗体和一定量酶标抗体竞争固相抗原。标本中抗体量越多，结合在固相上酶标抗体愈少，所以阳性反应呈色浅于阴性反应。
⑤.竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法两个以上位点，所以不能用双抗体夹心法进行测定，能