免疫组化操作规程和操作流程.doc

免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来,借助显微镜( 包括荧光显微镜、电子显微镜) 的显像和放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质( 如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。三、试剂配制 1. M PBS(pH ): g NaCl + 50 ml M PB 加双蒸水至 1000 ml ; 1000 ml PB (pH ) = g NaH 2 PO 4· 2H 2O+ g Na 2 HPO 4· 12H 2O in 1000 ml 双蒸水或= 190 mlA+ 810 mlB ( A. M NaH 2 PO 4· 2H 2O : g in 500 ml ddH 2O ; B. M Na 2 HPO 4· 12H 2O: g in 1000 ml dH 2O)。 2. Citrate Buffered Saline ( M 柠檬酸缓冲液, ): 28 mlA+ 72 mlB+ 200 ml ddH 2O( acid (柠檬酸): g 加双蒸水至 1000 ml ; sodium (柠檬酸钠): g 加双蒸水至 1000 ml )。 3. 细胞通透液: 由终浓度分别为 % 双氧水和 %Triton X-100 混合而成。配制方法是先用微波加热的 36 ml PBS ,再接着加 120 ul TritonX-100 ,并加热一会儿,冷却至临用前加 ml 30 %H2O2。 %羊血清或封闭血清,用 PBS 稀释。 %H2O2的 % DAB (避光) :用 20 × DAB (1 %, 10 mg/ml )5 ul+ ul 30% H2O2 + 95 ul PBS 。 6. 一抗、二抗均用 PBS 稀释。 7. Xylene 、梯度 Ethanol ( 100 %×2 、 95 %、 80 %、 70 %、 50 %) 、双蒸水、中性树胶(封裱剂)。 8. 苏木精染液: 四、操作步骤 1 、脱蜡、水化 1) 60 ℃× 20 min → Xylene 2× 10 minutes ; 2) 100% absolute ethanol :2×5 minutes ; 3) 95% ethanol 2 minutes ; 4) 80% ethanol 2 minutes ; 5) 70% ethanol 2 minutes ; 6) distilled water:5 min ; 7) PBS 洗3次×3 min 。 2 、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 8) 用封闭通透液浸润切片 30 min ( RT 避光) 。配法是用预热 40 ml PBS 加 120ul TritonX-100 加热几