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PCR体系优化.docx


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由于TaqDNA聚合酶是目前PCR反应体系中应用最广泛的酶, 因此此文主要讨论使用该酶的PCR反应体系。A镁离子浓度镁离子是热稳定DNA聚合酶的辅因子,其浓度对PCR至关重要。模板DNA的浓度,鳌合物(如EDTA和柠檬酸盐)、dNTP浓度和蛋白都会影响反应体系中游离镁离子的量。如果游离的镁离子含量不够,那么 TaqDNA聚合酶则无法行使功能(figurel)。过多的游离镁离子则会降低酶的保真度, 可能会增加非特异性扩增。 因此,研究者应当根据实际的实验结果来优化每一反应中镁离子的浓度。可以用一系列的镁离子浓度梯度来验证, 镁离子浓度范围为1~~1mM扩增产量最高,非特异性产物最低时的镁离子浓度即为最优。最优镁离子的浓度范围跟 DNA聚合酶的类型相关,例如,PfuDNA聚合酶似乎对镁离子的依赖性更低,但其优化范围通常为 2~6mM许多DNA聚合酶产品提供Mg-freereactionbuffer和单独一管25mMMgCl2,这样就可以自行调节Mg+浓度,优化反应体系。 MgC2溶液在反复冻融后会出现浓度分层,为获得均一的溶液,在配液的时候,要确保 MgCb溶液完全溶解并充分震荡混匀。非常简单的两步,溶解和混匀,常常会造成实验失败。有些科学家倾向于使用包含 MgCb的buffer,。值得注意的是有文献报道发现使用此类 buffer的结果并不稳定,有时体系内游离镁离子的浓度会有 ,如果在90C加热10min,则结果趋于稳定,因此作者假设反复冻融的 buffer中MgCb可能会有沉淀现象发生。-,,。用不同浓度 Mg2+测试,,EB染色泳道M为MAKER;Lane1,0mMMg2+;Lane2,+;Lane3,1mMMg2+;Lane4,+;Lane5,2mMMg2+;Lane6,+;Lane7,3mMMg2+andLane8,+BBuffer缓冲液大多数Buffer里含有一种缓冲试剂,多数为基于Tris的缓试剂。此外还有盐类,通常为KCL缓冲试剂调节反应体系的 pH值,pH值会影响DNA聚合酶的活性和保真度。与不添加KCL的比,适量的KCL能够增加50~60%DN骤合酶的活性。一般来说,KCL浓度为50mM。C酶浓度我们推荐(promega的科研人员)在50微升体系中使用1-。多数情况下,这些酶是过量的,再添加酶并不能显著提高产物量。事实上,酶量不断升高会增加TaqDNA聚合酶5'宀3'外切酶活性,跑胶的时候会观察到弥散的条带。想要准确吸取少量的含50%甘油的酶溶液是非常困难的, 因此建议一次配置大量的预混液,这样酶的加量便会很大,减少误差。DPCR引物设计引物决定扩增区域和扩增子的大小, 引物长度一般在15~30bp。理想状态下的引物其GC含量应该在40~60%避免在引物3端出现三个连续的G或C以减少非特异性结合。还要避免自身或者引物间互补,以降低引物二聚体。引物自身二级机构干扰退火时引物与模板的结合。正反向两条引物之间 Tm

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  • 时间2020-09-28