蛋白表达纯化研究目的:生物学活性纯度数量目的蛋白性质:,基因工程操作方便,商品化表达载体种类齐全,表达效率高基本不分泌,容易形成包涵体,无糖基化等翻译后修饰真核表达系统可进行分泌表达,有天然立体结构及翻译后修饰表达量较低,培养成本较高,操作较复杂表达系统选择:目的蛋白性质,研究目的3大肠杆菌表达形式可溶性表达:目的蛋白含有二硫键且需要正确的立体结构包涵体表达:无活性要求,温度和诱导剂浓度影响融合表达:小分子蛋白大肠杆菌表达载体融合表达:融合各种tag,GST,CBD,GFP等单纯表达:pJLA系列,用NcoI/NdeI导入AUG的载体NdeI识别序列:5'CA^TATG3'IPTG诱导:lac,T5,T7启动子热诱导:lamdaphagePL和PR启动子表达载体选择:研究目的,:。,mRNA二级结构等的优化。,将目标基因亚克隆到合适的复制质粒上。提取mRNA,逆转录PCR得到cDNA7大家有疑问的,可以询问和交流可以互相讨论下,:。。。:。。,SDS-PAGE检测蛋白表达情况,筛选出合适菌株。:,温度以及IPTG浓度等表达条件进行优化,诱导表达目标蛋白。,通过亲和,离子交换,疏水及凝胶过滤等层析方法纯化表达的重组蛋白。-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。-blot验证目标蛋白正确性,根据蛋白质性质检测其活性10
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