蛋白提取方法.doc

ﻫ1材料与方法1、1材料1、1、1组织与细胞得来源:ﻫ1。1、2仪器设备ﻫ机械组织匀浆器ﻫ低温高速离心机(>40,000g)超速离心机ﻫ超生细胞破碎仪超纯水装置ﻫﻫ1、1。3试剂三***醋酸(TCA)***二硫苏糖醇(DTT)ﻫ尿素ﻫCHAPS ﻫPMSF ﻫEDTAﻫ乙醇ﻫ磷酸考马斯亮蓝R350ﻫ抑肽素Aﻫ亮肽素试剂纯度均应就是分析纯或以上。ﻫ1。1、4 溶液配制ﻫ(1)PBS:ﻫNaCl 8g, KCl0、2g, Na2HPO41。44g, KH2PO4,溶于800ml水中,,用纯水定容至1L;ﻫ(2) EDTA储存液: gNa2EDTA•2H2O,溶于70ml纯水中,用10mol/L (约需2gNaOH颗粒),定容为100ml、可高压灭菌后分装备用; ﻫ(3)亮肽素储存液(50μg/ml,100×) 10 mg/ml溶于水,-75℃保存;使用时配成50μg/ml储液,-20℃保存;(4)抑肽素储存液(70μg/ml,100×)1mg/ml溶于甲醇,—75℃保存;使用时配成70μg/ml储液,-20℃保存;(5)PMSF储存液(10mM, 100×): mg PMSF,溶于1ml异丙醇中,—20℃保存。ﻫDTT 储存液(1M):ﻫ0。31 gDTT溶于2ml H2O中,-20℃保存(DTT或含有DTT得溶液不能进行高压处理,可过滤除菌)。ﻫ(7)裂解液:LysisbufferA (9Murea, 4% w/vCHAPS,1%w/v DTT,% CAand a cocktail ofproteaseinhibitors)ﻫﻫLysis buffer B(7Murea,2 Mthiourea, 4%w/vCHAPS,1% w/vDTT, 0、5%CAanda cocktailofproteaseinhibitors)ﻫLysisbuffer C40mMTris-base(pH9。5) inultrapureH2OLysisbufferD(8M urea,4% CHAPS,40mMTris(base),40ml)ﻫLysisbuffer Eﻫ(5Murea, 2M thiourea,2%SB 3-10,2% CHAPS, 1%w/v DTT,0、5%CAand a cocktailof protease inhibitors)ﻫLysisbufferFﻫ100 μLSDSsamplesolution(1%w/v SDS,0、375MTris-HCl,pH 8。8,50mMDTT, 25%v/vglycerol)●CA、蛋白酶抑制剂混合物与DTT在临用前加入。ﻫ蛋白酶抑制剂混合物[3]ﻫ  成分  终浓度ﻫ蛋白酶抑制剂混合物  PMSF  35μg/ml or1mM  EDTA  0、3mg/ml(1mM)  抑肽素  0。7μg/mlﻫ  亮肽素  0、5 μg/。、。1三***醋酸/***沉淀法[1]ﻫ(1)冰上取材,称湿重,置液氮中冻存或直接进行下一步;(2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织;ﻫ(3)将粉末悬浮于含DTT(0。2%w/v)得10%三***醋酸(w/v)得***溶液中;(4)蛋白–20℃沉淀过夜;ﻫ(5)35000×g(6