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生物基因工程专题报告深圳源动力生物技术有限公司一、原核基因工程上游技术二、原核基因工程下游技术一、原核基因工程上游技术大肠杆菌表达系统的特点遗传背景清楚,容易审批,例如:,年销售额超过二十亿美元。容易大规模发酵克隆和表达的各种载体和菌株齐全背景文献丰富,上下游配套技术产品齐全易形成包涵体,,如IL-11、G-CSF、GM-CSF、INF、IL-3、IL-6、Insulin、IL-2等均可获得正确折叠的重组可溶性活性蛋白原核表达系统近年来研究取得突破性进展1998年,美国IncytePharmaceutical公司华裔科学家ZhangYang在《Proteinexpressionandpurification》(vol12,159-165)上发表论文《ExpressionofEukaryoticproteinsinsolubleforminEscherichiacoli》,-I、IGFBP-3、3Cproteinase、TGFb-2、STGFb-RII、BDNF、GDNF、mEGFBP、Leptin和GFP十个基因全部实现了可溶性表达,且表达量均大于25%。更为惊奇的是由于DsbA分子伴侣的作用使得拥有9个半胱氨酸的复杂结构的IGFBP-。2002年,美国冷泉港实验室出版的《ProteinScience》(2002,11:313-321)上发表了瑞典科学家Torleif《RapidscreeningforimprovedsolubilityofsmallhumanproteinsproducedasfusionproteinsinEscherichiacoli》一文,从而揭开了原核高效快速组合筛选表达系统用于蛋白组学研究的序幕。近年来Medline报导了大量利用原核表达获得有活性的可溶蛋白,现举例如下:(2):175-85htPADsbAcoexpressionApplEnvironMicrobiol199864(12):4891-6BovineenterokinaseDsbAfusionBiotechnology(NY),1995,13(9):982-7MucinMBPfusionProteinExprPurif1999,15(1)146-54HumanangiogeninOmpAsignalBiochemMolBiolInt1999,47(2):267-73BacilluslipaseOmpAsignalApplMicrobiolBiotechnol1998Apr;49(14):405-10HEVantigenThioredoxinfusionZhonghuashiyanhelinchuangbingduxuezazhi2002,16(1):20-2P55TNFreceptorThioredoxinfusionProteinExprpurif2001,23(2)226-32hLH/CGreceptorThioredoxinfusionEndocrine2001,14(2):205-12PokeweedantiviralproteinMBPfusionProteinExprPurif1999,15(1)146-54原核基因表达定位表达的外源蛋白定位于胞内表达定位在胞质膜上分泌外源蛋白到胞周质分泌到胞外培养基表达外源蛋白定位于菌体表面如脂蛋白、外膜蛋白、鞭毛蛋白影响大肠杆菌中外源基因表达的因素1、表达载体的选择2、密码子的选择大肠肝菌偏爱密码子表附后3、翻译起始区4、宿主的选择及培养条件的控制5、折叠酶共表达、分子内伴侣和分泌表达可最大程度地避免包涵体形成。基因表达是一项很复杂的工作,由于特定蛋白可否在大肠肝菌中按需要表达,目前尚无法预知,比较可行的办法是同时试验多种表达方法。基因高效快速表达试剂盒深圳源动力生物技术有限公司代理美国基因动力实验室的原核基因高效快速表达试剂盒将九种表达载体包括分泌型、引导分泌型、胞内直接表达型、分子内伴侣协助折叠型、高度稳定伴侣型等系统的多克隆位点统一,同时统一了诱导表达剂和统一了培养基,一次可以同时克隆九种载体进行表达筛选,极大地节省宝贵的科研时间。其实,象美国Amgen、Gentech、Incyte这类顶尖的生物技术公司也是采用多系统多载体同时筛选快速表达的策略。这一策略的最大优势就是快速且成功率高。本系统非常适合高通量快速筛选大量未知基因,对基因组学和蛋