噬菌体展示技术.ppt

主讲:叶思灵噬菌体展示技术1精选课件什么是噬菌体展示是一项筛选技术,将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达,融合蛋白展示在病毒颗粒的表面,而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内。表型————基因型展示肽————编码基因使大量多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系,使各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)的多肽配体通过淘选得以快速鉴定简介2精选课件Landmarksofphagedisplay1985第一次发表噬菌体展示技术;;228:1315-71988噬菌质粒系统1990抗体片段的展示1993展示cDNA文库1994/1995研发了‘phagetwo-hybrid’binationofphagedisplaywithhigh-densityarrays2001AutomatedphagedisplayselectionKillingcancercellsbytargeteddrug-carryingphagenanomedicinesPublished:3April2008BMCBiotechnology2008,8:37doi:-6750-8-373精选课件展示系统 DisplaySystemCellBased1、PhageDisplay2、CellSurfaceDisplayCellFree1、RibosomeDisplay2、mRNADisplay4精选课件噬菌体展示系统的分类根据噬菌体不同PhageM13,f1,fdT7,T4,lamda根据载体不同VectorTruePhagePhagemid根据文库不同Library随机肽库、cDNA文库、抗体文库、蛋白质文库5精选课件M13噬菌体的组成和结构丝状噬菌体:M13、f1和fd。􀂾单链DNA病毒,6407bp。􀂾基因组编码11种蛋白质,其中5种为结构蛋白质。􀂾与展示密切相关的有两种结构蛋白质。DNA在细菌内滚环复制,细菌不被裂解,但生长速度减慢,;􀂾病毒ssDNA进入细菌的胞浆合成dsDNA;􀂾以dsDNA为模版合成所有的病毒蛋白,且通过滚环复制合成组装病毒所需的ssDNA。第一代噬菌体在感染10分钟后出现在培养液中(37℃)。􀂾感染后1小时内平均每个细胞分泌1000个噬菌体。7精选课件次要衣壳蛋白pIII406aa组成,5个拷贝,位于噬菌体的尾部。􀂾由三个功能区组成:􀂾􀂾N1穿膜区:;与噬菌体的入侵有关。􀂾􀂾N2受体结合区:负责结合F菌毛。􀂾􀂾CT疏水区:组装前黏附在细菌内膜上;与噬菌体组装终止有关。􀂾􀂾G1、G2:甘氨酸片段,在感染过程中,增加各个功能域之间的灵活性。8精选课件主要衣壳蛋白pVIII􀂾每个病毒子含约2700个拷贝,约10%能有效地融合外源多肽或蛋白。以pIII融合子方式表达的多肽是低价的,而以pVIII融合子方式表达的多肽则是高价的(每个病毒子~200个拷贝)。􀂾这种高价pVIII展示所增加的亲和力有利于筛选到亲和力非常低的配体,而低价pIII展示则将筛选限制在具有较高亲和力的配体上。􀂾(每个病毒子展示5个拷贝的外源多肽)。9精选课件pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同?pVIII展示的多肽比较小,如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组装。pIII只要不影响感染,可以展示300aa的多肽。噬菌质粒能展示的蛋白已经达到86kDa。丝状噬菌体展示系统一般是在包膜蛋白pIII或pVIII的N端融合外源多肽。每个病毒子含5个拷贝的pIII蛋白,这五个蛋白都可以融合短肽而不影响噬菌体的感染力。拷贝数不同。10精选课件