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分子生物学北京培训内部讲义.doc


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第一部分DNA重组技术实验一聚合酶链反应【实验目的】掌握基本PCR扩增方法及PCR反应条件优化。【实验原理】用PCR方法进行的基因扩增过程类似于体内DNA的复制过程。主要是利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的过程,模仿体内的复制过程,在附加的一对引物之间诱发聚合酶反应。PCR全过程是由变性、模板与引物结合(复性)及引物延伸三个步骤组成的不断重复的过程。每次重复的三个步骤称为一个周期,经过25~30个周期之后,PCR产物以指数方式增加可达106~107。目前,人们已根据各种用途设计了不同的特殊PCR,本实验介绍的是经典PCR技术。【实验材料】(一)模板DNA:模板可以是单链或双链;可以是染色体DNA;亦可以是克隆的质粒DNA。-FHL2(1μg/μl)经100倍稀释作为模板。~1μg大肠杆菌基因组DNA10~~~5ng(二)2×TaqPCRMasterMix:/µl,500μMdNTPeach,20mMTris-HCl(),100mMKCl,3mMMgCl2,其它稳定剂和增强剂,使用终浓度为1×PCRbuffer。适用于常规PCR反应、复杂模板如GC含量高(>60%),有二级结构等的扩增和大规模基因检测。(三)引物:PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核苷酸引物的正确设计。:本实验PCR扩增片段FHL2大小约851bp。P1(FHL2-M1):5'-gtatgactgagcgctttgactg-3'P2(FHL2-M2):5'-acagtc-3',使用前应先离心,然后再打开管盖溶解。通常配成贮存液浓度100pmol/ul,-20℃保存,使用浓度10pmol/ul,。:例一:⑴假设引物合成量为1OD,配成贮存液浓度100pmol/L;引物长度20nt;A/G/C/T平均分子量为324;因此,总分子量:20×324=6480⑵1OD260=33ug,引物浓度为33ug/6480===⑶引物稀释:=,,贮存浓度为100pmol/ul。例二:直接法计算贮存浓度为100pmol/ul。预稀释引物的微升数(ul)=OD数×33×10000引物分子量【实验反应条件设置】:①模板热变性②退火③寡核苷酸延伸⑴变性温度与时间:①由G+C含量决定;②由DNA分子长度决定⑵退火温度与时间:取决于引物的长度、浓度和G+C含量。引物长度为15~25时,退火温度可选用Tm-5℃,时间30sec。⑶延伸温度与时间:72℃10min。⑷循环数一般以20~30次为宜。【实验器材】【实验步骤】一、µlPCR反应体积配制反应混合液,,按下列程序依次加入试剂(装有2×TaqPCRMasterMix的PCR管为反应管),注意:模板DNA最后加,防止污染。成分加量(ul)~10ngM1(上游引物)(下游引物)××、,短暂离心以集中液体,置PCR仪依下述条件进行反应。PCR反应预变性变性退火延伸总延伸循环周期194℃5min1294℃1min60℃40sec72℃40sec33372℃10min1注意:反应结束后,如不立即使用,可将样品于-20℃暂时保存。三、%琼脂糖凝胶。往25µlPCR产物中加入10×上样缓冲液4µl,取5µl上样进行电泳,观察结果。本实验PCR扩增DNA特异片段大小约851bp。其余样品用于实验三“PCR产物回收”。【注意事项】PCR反应体系中的任何一个成分,对其结果都是非常重要的。由于PCR是以指数方式扩增,极微量的DNA污染都可能造成假阳性结果,因此反应体系的干净程度是非常重要的。需要实验者在操作中加以注意。、配制反应液、循环扩增及产物的鉴定四部分。实验前应用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。分装PCR试剂所有的PCR试剂都应小量分装,-20℃保存。

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  • 上传人sanshenglu2
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  • 时间2020-08-12