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一代,二代,三代测序技术.doc
文档介绍:
三代基因组测序技术原理简介摘要:从1977年第一代DNA测序技术(Sanger法)1,发展至今三十多年时间,测序技术已取得了相当大的发展,从第一代到第三代乃至第四代,测序读长从长到短,再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置,但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革,也都对基因组研究,疾病医疗研究,药物研发,育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。图1:测序技术的发展历程生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上(图1)所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来,整个测序技术的发展历程。第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格(Sanger)和考尔森(Coulson)开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆(Maxam)和吉尔伯特(Gilbert)发明的化学法(链降解).并在1977年,桑格测定了第一个基因组序列,是噬菌体X174的,全长5375个碱基1。自此,人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力,并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年,完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础,Sanger法核心原理是:由于ddNTP的2’和3’都不含羟基,其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键,因此可以用来中断DNA合成反应,在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP(分为:ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP),通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列(图2)。这个网址为sanger测序法制作了一个小短片,形象而生动。值得注意的是,就在测序技术起步发展的这一时期中,除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术,如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中,焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4,而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4,但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。 图2:Sanger法测序原理第二代测序技术总的说来,第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp,准确性高达99.999%,但其测序成本高,通量低等方面的缺点,严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。经过不断的技术开发和改进,以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa,Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术大大降低了测序成本的同时,还大幅提高了测序速度,并且保持了高准确性,以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间,而使用二代测序技术则仅仅需要1周,但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。表1和图3对第一代和第二代测序技术各自的特点以及测序成本作了一个简单的比较5,以下我将对这三种主要的第二代测序技术的主要原理和特点作一个简单的介绍。  图3.测序成本的变化IllumineIllumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器,这两个系列的技术核心原理是相同的2,4。这两个系列的机器采用的都是边合成边测序的方法,它的测序过程主要分为以下4步,如图4.    (1)DNA待测文库构建利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段,目前除了组装之外和一些其他的特殊要求之外,主要是打断成200-500bp长的序列片段,并在这些小片段的两端添加上不同的接头,构建出单链DNA文库。    (2)FlowcellFlowcell是用于吸附流动DN***段的槽道,当文库建好后,这些文库中的DNA在通过flowcell的时候会随机附着在flowcell表面的channel上。每个Flowcell有8个channel,每个channel的表面都附有很多接头,这些接头能和建库过程中加在DN***段两端的接头相互配对(这就是为什么flowcell能吸附建库后的DNA的原因),并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。    (3)桥式PCR扩增与变性桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为模板,进行桥形扩增,如图4.a所示。经过不断的扩增和变性循环,最终每个DN***段都将在各自的位置上集中成束,每一个束都含有单个DNA模板的很多分拷贝,进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大,以达到测序所需的信号要求。 (4)测序测序方法采用边合成边测序的方法。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱 内容来自淘豆网www.taodocs.com转载请标明出处.
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  • 上传人一叶轻舟
  • 文件大小3.37 MB
  • 时间2020-08-12
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