单克隆抗体制备常见问题分析.doc

单克隆抗体制备常见问题分析一、前言1975年,Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元,也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产,要经过几个月的一系列实验步骤。虽然单抗技术已经非常成熟,但是由于其经济价值,仍然有很多人在从事这项研究,而且其中也会遇到很多这样那样大问题。我本人就是其中一个,由于是第一次做单抗,所以过程中遇到了很多困难,终于在前几天得到了几株阳性克隆。鉴于此,我将单克隆抗体制备的整个过程贴出来,同时搜索了园子里面一些战友的求助帖以及一些经典的应助帖,希望能对将要或是正在从事这项研究的战友们有些帮助。二、动物的免疫选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10,,(腹腔内注射)?2,3周后第二次免疫1×10,,?3周后加强免疫(融合前三天)1×10,,(静脉内注射)?,一般要加佐剂,常用佐剂:福氏完全佐剂,福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状,放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。初次免疫Ag1,50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射?(,,点)?3周后第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip?()?3周后第三次免疫剂量同上,不加佐剂,ip?(5,7天后采血测其效价,检测免疫效果)?2,3周后加强免疫,剂量50,500μg为宜,ip或iv?3天后取脾融合目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如?将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。?改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。?使用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,促进免疫细胞对抗原反应性。(1)请问制备单抗时,免疫的BLAB/c小鼠选择的是雌性还是雄性,两者有何差别,免疫的BLAB/c小鼠选择的应该是雌性,雌性的反应比雄性要好的多,具体的说免疫后血清滴度要比雄性的高2,3个数量级(2)本来加强免疫准备融合,但是瘤细胞出了点问题。所以请问从加强到融合最多能等几天,最好是3,5天,此时融合效果最好,融合率、成功率都较高。(3),共250ug,免疫完了之后,第二天,小鼠极瘦,精神特差,准备第三天就要融合,担心小鼠死亡,可是小鼠不死,那脾细胞会不会有问题,为什么会出现这种问题呢,注射的蛋白太多了,不清楚你基础免疫的用量。一般情况下冲击免疫的用量和基础免疫的量相同就好了。你如果基础免疫250微克/只,量太大了,小心免疫耐受。还有你的蛋白浓度如果足够大