单克隆抗体制备方案.doc

单克隆抗体制备方案细胞融合前准备一、,雌雄皆可,鼠龄8周左右。为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡,可同时免疫3~4只小鼠。 15ml离心管15个、50ml离心管7个、10ml注射器5支、Tip头20个、电子天平、CFA、PBS、CFA(使用前需震摇)50μg/只:称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中,充分混匀。取1ml加入7mlPBS中,混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中,加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃,用注射器反复推吸。取一滴加入水中,如果不立即散开,则乳化好。4℃保存。100μg/只:称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中,充分混匀。取1ml加入3mlPBS中,混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中,加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃,用注射器反复推吸。取一滴加入水中,如果不立即散开,则乳化好。4℃保存。150μg/只:称取90mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中,充分混匀。取1ml加入2mlPBS中,混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中,加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃,用注射器反复推吸。取一滴加入水中,如果不立即散开,则乳化好。4℃保存。200μg/只:称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中,充分混匀。取1ml加入1mlPBS中,混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中,加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃,用注射器反复推吸。取一滴加入水中,如果不立即散开,则乳化好。4℃保存。250μg/只:称取100mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中,充分混匀。取1ml加入1mlPBS中,混匀。从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中,加10mlCFA于该离心管中。反复摇晃,用注射器反复推吸。取一滴加入水中,如果不立即散开,则乳化好。4℃保存。:50μg、100μg、150μg、200μg、250μg抗原溶于PBS中,加等体积的福氏完全佐剂(CFA)腹腔和皮下注射。(共25只小鼠,每组5只,两只采用背部皮下注射,共1ml,,3只采用腹腔注射)3周后第二次免疫:与初次免疫等量的抗原溶液加等体积加福氏不完全佐剂(IFA),腹腔和皮下注射3周后第三次免疫:与初次免疫等量的抗原溶液加等体积加IFA,腹腔和皮下注射,5天后内眦静脉或断尾取血以ELISA间接法测效价2~3周后加强免疫:取初次免疫抗原一半的量溶于PBS,静脉或脾内缓慢注射,以免动物发生过敏性休克而死亡。3~4天后取脾细胞融合腹腔注射大鼠、小鼠一般一人即可注射:以左手大拇指与食指执住鼠两耳及头部皮肤,腹部向上,将鼠固定在手掌间,必要时,以左手无名指及小指夹住鼠尾;右手持连有5号针头的注射器,将针头从下腹部朝头方向刺入腹腔,回抽无回血或尿液,表示针头未刺入肝、膀胱等脏器,即可进行注射。进行腹腔注射时应注意:1、针头刺入部不宜太近上腹部或太深,以免刺破内脏。2、针头与腹腔的角度不宜太小,否则容易刺入皮下。3、用的针头不要太粗,以免药液注射后从注射孔流出。注射后用棉球按一下注射部位。4、为避免注射后药液从针孔流出,也可在注射时先使针头在皮下向前推一小段距离,然后再刺入腹腔。皮下注射皮下注射较简单,一般都取背部及后腿皮下。注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤,右手持注射器将针头刺入,固定后即进行注射。注射器针头不易进入,硬进容易折断针头,故给这些动物作皮下注射时不应选背部皮肤。一般狗、猫多在大腿外侧;豚鼠在后大腿内侧或小腹部;大鼠可在侧下腹部。兔在背部或耳根部注射。①免疫时抗原的剂量应根据其免疫原性制定,若免疫原性较弱,需在50~100μg基础上增加。②商品化的福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。抗原溶液的体积不能大于佐剂的体积,否则很难乳化好。一般首次注射时佐剂和抗原溶液的比例为1:1。③佐剂加入抗原后一定要充分混合成乳剂,混合的方法有研磨法和注射器混合法。乳化完全与否的鉴定方法是将一滴乳剂滴入水中,如立即散开,则未乳化好;如保持完整不散开,呈滴状漂在水面则为乳化完全。乳化过的物质放置一段时间出现油水分层也表明未乳化好。④测抗体效价的方法有ELISA间接法、免疫双扩散法、环状实验等。用双向免疫法测定时效价达到1:16以上可用于融合实验;用ELISA方法测定时效价达到1:16000后可用于融合。皮下注射给药皮下注射给药是将药液推入皮下结缔组织,经毛细血管、淋巴管吸收进入血液循环的过程。作皮下注射常选项背或大腿内侧的皮肤。操作时,常规消毒注射部位皮肤,然后将皮肤提起,注射针头取一钝角角度刺入皮下,把针头轻轻向左右摆动,易摆动则表示已刺入皮下,再轻轻抽吸,如无回血,可缓慢