微卫星引物筛选步骤.doc

Ⅰ对四种鱼(GC、GS、NL和ZZ)基因组DNA(需基因组DNA浓度较高)进行酶切。反应体系为:ddH2O15µLVspⅠbuffer2µLVspⅠ酶1µLDNA2µL总体积20µL酶切在37℃反应3~4h即可,但是为了提高酶切效率可切4~6h。PCR反应程序为:94℃5min,(94℃1min,53℃1min,72℃1min)×30,72℃10min,4℃hold。VspⅠ酶即(AseⅠ酶):酶切识别位点为:5’AT↓TAAT3’5’TAAT↑TA3’AseⅠ酶的接头为:A1:5’3’A2:5’TAGGTACGCAGTC3’AseⅠ酶用的预扩增产物为:A3:5’TAAT3’µLA1(200µM)和10µLA2(200µM)混合,94℃3min后室温放置30min。,命名为AE。连接反应体系如下:ddH2O5µµLT4buffer4µL酶切产物20µLATP(10mM)µLAE1µµL上述混合体系在16℃连接过夜。10h左右。,每个样本做4管。扩增引物为A3。反应体系如下:ddH2O14µL10×µLMg2+2µLdNTPs(10mM)µLA31µLDNA(连接产物)5µLTaqE(/µL)µµLPCR反应程序为:(94℃30sec,56℃1min,72℃1min)×20,72℃10min,4℃hold。,即400~1000bp较好。↓向其中加入1/10总体积预冷的3MNaAC和2倍体积预冷的无水乙醇(或者等体积预冷的4MNH4AC和2倍体积预冷的异丙醇)↓-20℃放置30min(该步可在-20℃长期保存)↓室温,12000rpm离心10min↓弃上清,加入1ml左右70%乙醇洗涤一次↓室温,12000rpm离心5min↓弃上清,干燥后加入20µLddH2O溶解即可(可以根据沉淀量加入ddH2O)~500ng回收DNA与50~80pmolbio-SSR探针混合,×%SDS。具体杂交体系如下:µL20×SCC21µL10%µL回收产物3µLbio-SSR探针(AC)µL总体积100µLPCR反应程序为:95℃5min,在58℃可以保存,但是不能时间长。在此过程中可以准备磁珠。bio-SSR探针序列可以为(AC)10、(AC)15、(AC)12或者AG重复均可,这个可以根据基因组序列确定。)2mgbeads(200µL)(根据DNA沉淀的多少决定所用磁珠的量,在100~200µL之间,在解冻磁珠时应轻柔的上下颠倒,不能用力)放置在磁力架上,使其吸附到EP管的一侧,然后从另一侧吸弃清液,再加入1mLTEN100洗涤,轻柔颠倒混匀,使磁珠和TEN100充分混合2min左右,然后放到磁力架上吸附,如此反复3次即可。2)用40µLTEN100溶解最后一次聚集的磁珠。3)为减少特异性吸附向上述混合液中加入2µ