产高效细菌素乳酸菌的筛选及鉴定.doc

产高效细菌素乳酸菌的筛选及鉴定摘要:本研究旨在从自然生境中筛选产高效抑菌蛋白的乳酸菌,并进行抑菌活性分析和菌种鉴定。通过牛津杯法抑菌试验对样本中乳酸菌进行初筛,然后对发酵液进行排除酸、过氧化氢干扰和蛋白酶处理,进一步复筛出产抑菌蛋白的乳酸菌。通过形态学、生理生化、糖发酵(API)和16SrDNA基因序列同源性分析进行菌种鉴定。结果表明:本研究成功地筛选出2株对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等致病菌有高效抑制作用的乳酸菌(抑菌圈直径均>20mm),证明其抑菌物质为蛋白类物质并推测为细菌素,菌种鉴定为植物乳杆菌和粪肠球菌。本试验对高效细菌素—乳酸菌的研究为食品及饲料行业中乳酸菌素的开发和应用提供参考。关键词:乳酸菌;细菌素;筛选鉴定;抑菌活性畜牧生产中抗生素滥用、病源微生物耐药性等问题严重威胁着食品安全及人类健康,越来越多的研究致力于寻找新型安全有效的绿色饲料添加剂作为理想的抗生素替代品。细菌素是细菌在生长过程中通过核糖体途径合成并分泌到环境中的具有抑菌作用的蛋白或多肽物质,具有高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性等优点[1]。目前国内外对细菌素的研究主要集中在芽孢杆菌和乳酸菌上,乳酸菌是一类可发酵碳水化合物、产生大量乳酸(>50%)的革兰氏阳性球菌或杆菌的统称[2]。饲料中添加乳酸菌制剂可以促进动物胃肠道微生态平衡,改善动物健康[3]。我国《饲料添加剂品种目录(2010)》中允许添加的29种微生物菌种中有9种属于乳酸菌属。添加植物乳杆菌的发酵饲料中粗蛋白、粗脂肪含量明显上升,提高饲料利用率[4]。Riboulet等[5]研究表明,乳杆菌素Abp118对小鼠和猪的肠道沙门氏菌等致病菌有显著的抑制作用并影响动物机体免疫力。因此对乳酸菌细菌素抑菌能力的挖掘成为开发绿色饲料添加剂的重点。本试验旨在筛选出对病原菌有高效、广谱抑菌活性的产细菌素乳酸菌菌株,并对其进行菌株鉴定,为天然安全的饲料添加剂的开发提供理论依据。(酸菜、生牛奶、青贮料、土壤等);指示菌为单增李斯特菌();金黄色葡萄球菌();藤黄八叠微球菌();大肠杆菌();沙门氏菌();培养基(MRS、BPY、LB等),药品采用国产分析纯;细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化有限公司);AnalyticProductsINCAPI50CH试剂盒(法国梅里埃)。16SrDNA的PCR扩增引物27F:5′-TGGCTCAG-3′、1525R:5′--3′。:将收集的样本悬浮于无菌生理盐水中按梯度稀释,涂布于含溴甲酚紫指示剂(%)的MRS琼脂平板上,37℃培养箱培养48h,挑选培养基变黄的菌落划线纯化,选取镜检革兰氏染色阳性、无芽孢的菌株于MRS液体培养基中37℃培养12h作为种子液。种子液按2%接种于新的MRS液体培养基37℃静置培养36h作为发酵液。以8000r/min离心10min,取上清液备用。指示菌的制备:选取的4株指示菌中大肠杆菌用LB培养基,其余用BPY培养基,种子液按2%接种于液体培养基37℃、150r/min摇床过夜(浓度约达109个/mL),稀释到107CFU/mL备用。菌株抑菌试验初筛:采用牛津杯法。取备用指示菌(107CFU/mL)150μL涂布于BPY琼脂平板上,放置3个牛津杯/板,常温干燥30min。取菌株发酵上清200μL加入牛津杯内,以空白培养基为对照,3个重复/样,置于37℃培养24h,测定抑菌圈直径d(mm)。选取抑菌效果较好的菌株进行复筛,用甘油-20℃保种备用。。检测各菌株发酵上清液的pH值,并对发酵上清进行排酸、过氧化氢酶和蛋白酶处理:①上清原液;②;③、蛋白酶(1mg/mL)处理,37℃[6];④对照:用乳酸、。牛津杯法测抑菌活性。选用单增李斯特菌、藤黄八叠微球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌作为指示菌,牛津杯法测定各菌株发酵上清抑菌活性,分析各菌株抑菌效果并筛选出含有高效抑菌蛋白的乳酸菌作为目标菌株。:将目标菌株划线于MRS琼脂平板,37℃培养48h,观察菌落形态,挑取单菌落进行革兰氏染色镜检。生理生化鉴定:对菌株进行接触酶、***还原、产氨、水解、H2S、VP、吲哚、明胶液化等试验(参照《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》)[13];对菌株进行49种糖发酵试验(API50CH试剂盒)。将试验结果参照第八版《伯杰氏细菌鉴定手册》、《常见细菌系统鉴定手册》)并与API数据库进行比对。16SrDNA基