产阿魏酸酯酶乳酸菌的乳杆菌筛选以及基因克隆.doc

产阿魏酸酯酶乳酸菌的乳杆菌筛选以及基因克隆摘要:运用平板法和高效液相色谱法筛选出一株具有阿魏酸酯酶活性的发酵乳杆菌(9338),其酶活力为260mU/L,并成功运用鸟枪法对该菌株进行阿魏酸酯酶克隆并测序,为产阿魏酸酯酶益生菌的开发提供理论依据。关键词:阿魏酸酯酶,乳酸菌,平板法,高效液相色谱法,鸟枪法ScreeningandgenecloningofferulicacidesterasebyLactobacillusstrainsAbstract:,andtheenzymeactivitywas260mU/-:feruloylesterase;Lactobacillus;platedetection;highefficiencyliquidchromatography;shotgunsequencingmethod中图分类号::A文章编号:1002-0306(2013)20-0199-05收稿日期:2013-05-09*通讯联系人作者简介:卢颖欣(1988-),女,硕士研究生,主要从事乳酸菌基因方面的研究。阿魏酸是桂皮酸的衍生物之一,它在中药材例如当归、酸枣仁等中的含量很高,也是其中的有效成分。阿魏酸的毒性低,而且具有镇静、抗癌、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集、降血脂等独特的功能[1],因此在食品、医药工业上得到广泛的应用。但阿魏酸在植物中大部分以交联的形式存在,人和动物不能直接吸收这类阿魏酸,必须依靠微生物产生酯酶将阿魏酸游离出来。阿魏酸酯酶()是能够水解阿魏酸糖酯中的酯键,将阿魏酸释放出来的酶,它能与其他水解酶相互联合作用,较为彻底地降解细胞壁中的多糖和木质素[2-3]。自MacKenzie等首次在链霉菌中发现阿魏酸酯酶以来,至今已分离纯化近30种阿魏酸酯酶,但主要集中在青霉和曲霉,只有少数是来自于细菌,例如嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌等[4-10],而且它们的阿魏酸酯酶的酶学特性以及氨基酸序列都有所不同[13-15,17-18,20-21]。由于天然真菌生长、酶产量以及真菌对生长条件的种种限制都制约着酶法制备阿魏酸的工业化生产,而原核细胞表达的酶更能高效地利用大肠杆菌进行表达生产。1998年,Donagy和McKay筛选了近50株革兰氏阳性菌是否具有阿魏酸酯酶活性,结果发现LactobacillusfermentumNCFB1751的活性最高[11]。乳酸杆菌作为益生菌具有良好的调节肠道微生态等益生功能[13],而产阿魏酸酯酶的乳酸杆菌除了具备普通益生菌的功能外,还能通过阿魏酸酯酶的特性,水解阿魏酸酯中的酯键,释放出阿魏酸,有利于人体健康。Bhathena等[12]的研究表明,口服用Lactobacillusfermentum11976所作的胶囊能有效地提高人体肠道内阿魏酸酯酶的含量,从而提高食物中阿魏酸的生物利用率。目前,阿魏酸酯酶的活力检测方法有很多,其中包括高效液相色谱法[22]、毛细管区代电泳等[4,9-10]。Donagy和McKay运用平板法筛选了近50株具有阿魏酸酯酶活性的细菌[11],此方法简单易操作,但是仍存在一定的缺点:在平板上产生能产生透明圈的细菌只能证明其具有利用阿魏酸酯的能力,而是否具有阿魏酸酯酶的活性还需要进一步的检测。因此,本文建立了一种快速、准确、简单的产阿魏酸酯酶的细菌筛选方法,运用平板法和高效液相色谱对实验室的15株乳酸杆菌进行初筛和复筛,同时对于阿魏酸酯酶高产菌株进行基因克隆。(,,,)、嗜酸乳杆菌()、鼠李糖乳杆菌(,)、约氏乳杆菌()、德氏乳杆菌(