第七章DNA定点诱变Site-:分离自发突变体用物理、化学诱变剂处理活体诱变-整个生物体-目的基因上的突变极其有限体外诱变(invitromutagenesis)::定点诱变随机诱变易错PCR(error-pronePCR)DNA重排(DNAshuffling)体外随机引发重组(random-bination)交错延伸(staggeredextensionprocess,StEP):单个碱基的置换简单的插入或缺失系统的缺失、,引入突变的位置及其性质是随机的结果:在目的DN***段中引入大量的序列多样性,:①-5bp/目的基因有益突变有害突变②根据研究目的对突变体进行定向选择或筛选,找到感兴趣的突变颜色反应\水解反应\功能互补定向进化(directedevolution):一次突变难以得到满意的结果,:错误掺入诱变盒式诱变(cassettemutagenesis),使用具有错配倾向的DNA聚合酶以及反应条件,使碱基错误掺入到新合成的基因中TaqDNA聚合酶无3’-5’外切活性碱基错误掺入率10-7-10-3,20-25循环,10-3/bp但是:突变大多数为碱基置换,→(error-pronePCR)是指通过改变PCR反应条件来调整PCR反应中突变的频率,降低聚合酶固有的突变序列倾向性,提高突变谱的多样性,使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中,从而得到随机突变的DNA群体,最后用合适的载体克隆突变基因。连续易错PCR(sequentialerrorpronePCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板,连续反复地进行随机诱变。合适的DNA长度1kb,:增加MgCl2浓度到7mM,稳定非互补的碱基配对增加聚合酶量到5U,促使在错配碱基处继续延伸反应降低一种dNTP的量(降至1%-10%).在缺乏正确核苷酸时,聚合酶经短暂停留后,会插入另外3种可用核苷酸的一种加入次黄嘌呤dITP来代替被减少的dNTP,能与C、T、,Mn2+能降低聚合酶对模板的特异性增加dCTP和dTTP的浓度到1mM,促进错误掺入使用突变DNA聚合酶如MutazymeGC→AT10.
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