引物设计详细步骤.doc

一、引物设计stepbystep1、在NCBI上搜索到目的基因,找到该基因的mRNA,在CDS选项中,找到编码区所在位置,在下面的origin中,Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。2、用PrimerPremier5搜索引物①打开PrimerPremier5,点击sequence,出现输入序列窗口,Copy目的序列在输入框内(选择As),此窗口内,序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer,进入引物窗口。②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项,点击Search按钮,进入引物搜索框,选择“PCRprimers”,“Pairs”,设定搜索区域和引物长度和产物长度。在SearchParameters里面,可以设定相应参数。一般若无特殊需要,参数选择默认即可,但产物长度可以适当变化,因为100~200bp的产物电泳跑得较散,所以可以选择300~500bp.③点击OK,软件即开始自动搜索引物,搜索完成后,会自动跳出结果窗口,搜索结果默认按照评分(Rating)排序,点击其中任一个搜索结果,可以在“引物窗口”中,显示出该引物的综合情况,包括上游引物和下游引物的序列和位置,引物的各种信息等。④对于引物的序列,可以简单查看一下,避免出现下列情况:3’不要出现连续的3个碱基相连的情况,,否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括:Tm应该在55~70度之间,GC%应该在45%~55%间,上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多,大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息,包括,发卡,二聚体,引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色,表示存在该二级结构,点击该红色按钮,即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物,应该都不存在这些二级结构,即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物,所以要求可以适当放宽,比如引物存在错配的话,可以就具体情况考察该错配的效率如何,是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成,Oligo自身虽然带有引物搜索功能,但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.⑤在Primer5窗口中,若觉得某一对引物合适,可以在搜索结果窗口中,点击该引物,然后在菜单栏,选择pair,使用PDF虚拟打印机,即可转换为Pdf文档,里面有该引物的详细信息。3、用Oligo验证评估引物①在Oligo软件界面,File菜单下,选择Open,定位到目的cDNA序列(在primer中,该序列已经被保存为Seq文件),会跳出来两个窗口,分别为InternalStability(DeltaG)窗口和Tm窗口。在Tm窗口中,点击最左下角的按钮,会出来引物定位对话框,输入候选的上游引物序列位置(Primer5已经给出)即可,而引物长度可以通过点击Change-Currentoligolength来改变。定位后,点击Tm窗口的Upper按钮,确定上游引物,同样方法定位下游引物位置,点击Lower按钮,确定下游引物。引物确定后,即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。②Analyze中,第一项为Keyinfo,点击Selectedprimers,会给出两条引物的概括性信息,其中包括引物的Tm值,此值Oligo是采用nearestneighborme