单克隆抗体制备方法.ppt

单克隆抗体 Monoclonal Antibody 单克隆抗体(McAb) 1975 年英国科学家 Milstein 和 Kohler 将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合,成功建立了单克隆抗体技术,而获得 1984 年诺贝尔医学和生理学奖。每个 B淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某种抗原决定簇的特异性抗体,而肿瘤细胞可以无限增殖,因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内条件下分泌大量结构与特性相同的高纯度抗体。单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体。单抗的特点 ------- 始于一个 B细胞的单克隆系,均质 ------- 针对单个抗原决定簇反应,一般无交叉反应 ,产量大①探讨蛋白质的精细结构; ②淋巴细胞亚群的表面新抗原分析; ③组织相容性抗原; ④激素和药物的放射免疫(或酶免疫)分析; ⑤肿瘤的定位和分类; ⑥纯化微生物和寄生虫抗原; ⑦免疫-化学疗法( “导弹”疗法, 利用单克隆抗体与靶细胞特异性结合,将药物带至病灶部位)。可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究。应用杂交瘤细胞产生单克隆抗体示意图性质常规血清抗体单克隆抗体抗体含量少μg/ml 多 mg/ml 无关的 Ig多少或几乎无其它血清蛋白有少,培养物上清常有 10 %胎牛血清 Ag-Ab 结合免疫原的全部成分的全部抗原决定簇免疫原中的一种成分的一个抗原决定簇特异性亲和力的重复性不同批号间有变化无变化与其它抗原的交叉反应与带有共同抗原决定簇的抗原有部分交叉一般无。结合到共同决定簇则是完全的免疫球蛋白的种类与亚类完全是混合的只是一种或几种免疫球蛋白的物理性质典型光谱抗体的单一性质单抗与多抗主要步骤包括: (1)抗原制备; (2)免疫动物; (3)免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备; (4)细胞融合; (5)杂交瘤细胞的选择培养; (6)杂交瘤细胞的筛选; (7)杂交瘤细胞的克隆化; (8)单克隆抗体的检定; (9)单克隆抗体的大量制备。一、抗原提纯与动物免疫对抗原的要求是纯度越高越好 1 细胞抗原----- 可取 1× 10 7个细胞作腹腔免疫 2 可溶性抗原----- 需加完全福氏佐剂并经充分乳化 3 聚丙烯酰***电泳纯化的抗原------- 可将抗原所在的电泳条带切下, 研磨后直接用以动物免疫。 选择 BALB/c 健康小鼠,鼠龄在 8~ 12 周,雌雄不限。同时免疫 3~4只小鼠。 免疫过程因动物、抗原形式、免疫途径不同而异,以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般 2~3周。共计三到四次。分离脾细胞融合前 3~4天加强免疫一次。二、三种细胞 1 Sp2/0( 骨髓瘤细胞) 本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞。 2 饲养细胞 在体外培养条件下,细胞的生长依赖适当的细胞密度,因而,在培养融合细胞或细胞克隆化培养时, 还需加入饲养细胞( feedercell )。常用的为小鼠的腹腔细胞。 在制备饲养细胞时,切忌针头刺破动物的消化器官,否则所获细胞会有严重污染。小鼠腹腔巨噬细胞的制备 拉颈处死浸泡于 75 %酒精,消毒 3~5分钟↓ 用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜↓ 用无菌注射器注入 6~ 8ml 培养液↓ 反复冲洗,吸出冲洗液↓ 放入 10ml 离心管, 1200 转/分离心 5~6分钟↓用 20 %小牛血清(NCS) 的培养液混悬,调整细胞数 1× 10 5 / ml ↓ 加入 96 孔板, 100 μl/孔↓ 放入 37 ℃孵箱培养