吲哚对迟缓爱德华氏菌密度感应系统生物膜形成和菌体生长.doc

吲哚对迟缓爱德华氏菌密度感应系统、生物膜形成和菌体生长等生理影响研究杨韬陈浩陈晓吕辉摘要:吲哚阳性是该科细菌的鉴定指标之一。本实验通过添加外源吲哚研究其对迟缓爱德华氏菌的生长、酰基高丝氨酸内酯信号分子(AHLs)分泌以及生物膜形成的影响;实验结果显示吲哚对迟缓爱德华氏菌生长、AHLs产生和生物膜形成的影响均呈浓度依赖型。通过羟吲哚-L-丙氨酸对迟缓爱德华氏菌吲哚产生的生化抑制作用进一步证实了吲哚对迟缓爱德华氏菌生物膜形成的影响。同时发现低剂量的抗生素能够抑制细菌生长,但极大地提高了吲哚的产量。关键词:迟缓爱德华氏菌,吲哚,密度感应系统,生物膜,酰基高丝氨酸内酯信号分子引言我国自上世纪八十年代来,海水养殖业迅速发展。但随着高密度集约化养殖业的发展,病害问题日益突出。在细菌,病毒,寄生虫三大类病源中,细菌性病害具有发病广、传染扩散性强、种类演化快等特点,危害极其严重,已成为海水鱼类养殖持续发展的一大障碍。迟缓爱德华氏菌为当前水产养殖业中具有极大危害的重要病原菌之一,已经成为山东省鲆鲽鱼类养殖的首要病害,给养殖业造成了严重的经济和社会损失。由迟缓爱德华氏菌所引发的鱼类传染病,不仅具有流行面积广、发病率及死亡率高等特点,而且能引起多种鱼类感染发病,目前已引起水产养殖业的高度重视。近年来,在我国已报道多起鱼类及其他水产养殖动物迟缓爱德华氏菌的爆发,如发生在南方的鳗鲡,中华鳖和牛蛙的养殖以及北方的牙鲆,大菱鲆和舌鳎养殖等等。细菌可以通过合成和分泌大量不同的化学信号来与外界同种细菌及不同种的细菌发生联系。这些信号分子能够调控细菌多种生理功能,,如生物膜形成、毒性、泳动性以及生物荧光等(Mueller等,2009),有助于其在不利条件下的生存。目前研究较多的密度感应系统信号分子有酰基高丝氨酸内酯类自诱导分子(acyl-homoserinelactone,AHLs)、AI-2类自诱导分子(autoinducer-2,AI-2)和霍乱弧菌Ⅰ类自体诱导分子(choleraeautoinducer-1,CAI-1)。新的研究发现吲哚可作为一种较新的细菌信号分子参与细菌表型及毒力的调控。吲哚是由色氨酸酶(TnaA)(Evans等,1941)分解色氨酸产生的。在大肠杆菌Escherichiacoli(Wang等,2001)(Mueller等,2009)等一些细菌中,吲哚被认为是一种细胞间信号分子。在大肠杆菌中,吲哚被证明参与氨基酸新陈代谢(Wang等,2001)、密度感应系统(Lee等,2007)、多药耐药性外排基因(Hirakawa等,2005)、质粒多聚化、细胞分裂(ChantandSummers,2007)和III型分泌系统(TTSS)(Hirakawa等,2009)等一系列相关基因的调控。尽管大肠杆菌不产生AHL信号分子(Garbe等,2000;JayaramanandWood,2008),仍然可以通过吲哚诱导AHLs感应器SdiA来调控生物膜,其中SdiA能够调控菌体的泳动性及抗酸性。铜绿假单胞菌本身不产生吲哚(Lee等,2007),。通过转座子插入法构建霍乱弧菌的tnaA基因突变株,发现突变株生物膜形成明显减弱,而在突变株生长培养基中加入吲哚,可使突变株生物膜形成恢复正常。同时吲哚还影响着霍乱弧菌的弧菌多糖的产生,而弧菌多糖是生物膜的重要成分之一。另外,吲哚分子还影响着霍乱弧菌的泳动性、原生动物抗摄食性以及对铁的利用及吸收等(Mueller等,2007)。近年来研究已发现,迟缓爱德华氏菌存在密度感应的机制,即存在酰化高丝氨酸环内酯(AHLs)信号分子和呋喃糖基硼酸二酯(AI-2)两大类信号分子,且其密度感应系统参与生物膜的形成和III型分泌系统等致病相关基因的调控。迟缓爱德华氏菌与大肠杆菌同属肠杆菌科,吲哚阳性是该科细菌的鉴定指标之一。我们前期的研究发现迟缓爱德华氏菌能够产生大量的吲哚碱类物质,其中吲哚的产生量最大。因此研究吲哚对迟缓爱德华氏菌密度感应系统及生物膜形成等生理功能的影响将有助于进一步研究吲哚作为胞外信号分子参与迟缓爱德华氏菌相关致病因子的调控,为下一步通过控制吲哚水平,更有效、环保地控制迟缓爱德华氏菌引起的各种疾病提供理论依据。-4分离自07年春山东胶南某大菱鲆渔场发病的大菱鲆(Scophthalmusmaximus);AHL报告菌株农杆菌KYC55来自南京农业大学朱军老师。迟缓爱德华氏菌采用LB培养基,农杆菌KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410)采用AT培养基,所有菌株均在28℃培养。农杆菌KYC55所用抗生素浓度:氨苄青霉素:100μg/ml;卡那霉素: