微卫星引物筛选步骤.doc

Ⅰ对四种鱼(GC、GS、NL和ZZ)基因组DNA(需基因组DNA浓度较高)进行酶切。反应体系为:ddH2O          15μLVspⅠbuffer       2μLVspⅠ酶         1μLDNA           2μL总体积          20μL酶切在37℃反应3~4h即可,但是为了提高酶切效率可切4~6h。PCR反应程序为:94℃5min,(94℃1min,53℃1min,72℃1min)×30,72℃10min,4℃hold。VspⅠ酶即(AseⅠ酶):酶切识别位点为:5’AT↓TAAT3’5’TAAT↑TA3’AseⅠ酶的接头为:A1:5’3’A2:5’TAGGTACGCAGTC3’AseⅠ酶用的预扩增产物为:A3:5’TAAT3’(200μM)和10μLA2(200μM)混合,94℃3min后室温放置30min。,命名为AE。连接反应体系如下:ddH2O          5μLT4ligation酶                4μL酶切产物         20μLATP(10mM)          AE           1μL总体积          ℃连接过夜。10h左右。,每个样本做4管。扩增引物为A3。反应体系如下:      ddH2O          14μL10×buffer        +           2μLdNTPs(10mM)                 1μLDNA(连接产物)     5μLTaqE()               :(94℃30sec,56℃1min,72℃1min)×20,72℃10min,4℃hold。,即400~1000bp较好。↓向其中加入1/10总体积预冷的3MNaAC和2倍体积预冷的无水乙醇(或者等体积预冷的4MNH4AC和2倍体积预冷的异丙醇)↓-20℃放置30min(该步可在-20℃长期保存)↓室温,12000rpm离心10min↓弃上清,加入1ml左右70%乙醇洗涤一次↓室温,12000rpm离心5min↓弃上清,干燥后加入20μLddH2O溶解即可(可以根据沉淀量加入ddH2O)~500ng回收DNA与50~80pmolbio-SSR探针混合,×%SDS。具体杂交体系如下:ddH2O          ×SCC         21μL10%SDS                  3μLbio-SSR探针(AC)15        总体积          100μLPCR反应程序为:95℃5min,在58℃可以保存,但是不能时间长。在此过程中可以准备磁珠。bio-SSR探针序列可以为(AC)10、(AC)15、(AC)12或者AG重复均可,这个可以根据基因组序列确定。)2mgbeads(200μL)(根据DNA沉淀的多少决定所用磁珠的量,在100~200μL之间,在解冻磁珠时应轻柔的上下颠倒,不能用力)放置在磁力架上,使其吸附到EP管的一侧,然后从另一侧吸弃清液,再加入1mLTEN100洗涤,轻柔颠倒混匀,使磁珠和TEN100充分混合2min左右,然后放到磁力架上吸附,如此反复3次即可。2)用40μLTEN100溶解最后一次聚集的磁珠。3)为减少特异性吸附向上述混合液中加入2μL与之无关的基因组DNA(如植物基因组)。)将杂交体系与稀释的磁珠混合,再加入200μLTEN100稀释。2)室温放置30min,期间轻柔混合(不能用力过猛,因为该过程是目的片段与探针吸附)。(去掉多余DNA和杂质)将吸附好的磁珠放到磁力架上去除上清。1)松弛型洗涤:400μLTEN1000洗涤3次,每次5min,加入TEN1000后轻柔混匀。2)严谨型洗涤:12μL20×SSC+12μL10%SDS+1176μLddH2O,400μL/次,洗涤3次,每次5min,其间需轻柔混匀。(使SSC终浓度为20%,%)。)第一次洗脱:在磁力架上弃上清液,向磁珠中加入50μLTE,95℃5min后迅速取出将上清液吸入另一个管子中(若温度降低那么则会复性),放入-20℃保存。2