流式细胞仪操作方法.doc

流式细胞仪操作方法一、样品制备1、取样(大约1×106cells),离心弃上清,以PBS洗两遍,逐滴加入1ml70%的冷乙醇固定细胞,﹣20℃冻存过夜。分析时,离心弃上清,以PBS洗两遍,加入100μl的Rnase(GenScript试剂A),37℃水浴30min,然后再加入400μl的PI染液(GenScript试剂B),在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2×104cells,二、、打开液流抽屉,确认气压阀处于减压状态;打开金属挡板;取出鞘液桶,倒掉废液,将鞘液桶加至2/3满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFLow),拧紧鞘液桶盖,安上金属挡板,保证管路畅通无扭曲。检查废液桶,将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开,倒掉废液(加鞘液一定要倒废液)向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次***酸钠溶液,合上压力阀。确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置。、依此接通电源、打开稳压器电源(指示灯由bypass变Acputput)、变压器电源,稳定5分钟。将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY。如果需要打印,打开打印机电源。打开电脑(密码:BDIS),等待屏幕显示出标准的苹果标志(先开仪器,后开电脑主机)。、将压力阀置于加压位置,轻拍过滤器,使气泡位于滤器的上方,打开管路开关,将过滤器中的气泡排除,关闭管路开关。若滤器管路中有气泡,打开连接头,挤出鞘液,以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次,以排除Flowcell中的气泡(反向压力使鞘液从进样针中流出)。结束后自动STANDBY,5分钟后即可进行试验。、从苹果画面中选取CELLQuest,最大化,选散点图标,打开,Plottype选择Acq-analysis,X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H(选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群)。选择单参数图标,打开,Plottype选择Acq-analysis,X参数选择FL2-H1024(此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光,本实验使用PI作为荧光染料,故选择FL2-H)、从屏幕上方Acquire指令栏中,选取ConnecttoCytometer(快捷键:+B)进行电脑和仪器的连机。此时出现Parameterdescription对话框,选择BDfiles,设置文件存放的位置{在Acquire指令栏中,选择ParameterDescription,以决定文件存储位置(folder),文件名称(file),样品代号以及各种参数的标记(panel),即安排tube1,2,3…的检测参数。一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于FACStationG3\BDApplications\CELLQuest\XXX和DNA文件夹中。文件根据日期命名。}同时将出现的AcquisitonControl对话框,将其移至合适位置。、从Cytometer指令栏中,开启Detectors/Amps,pensation,Status等四个对话框,并将他们移至屏幕右方,以便获取数据时随时调整获取文件。也可以用&+1,2,3,4获得此四个对话框。、在Detectors/Amps(可通过调整电压,是FSC、SSC放大或者缩小